胡文文，王嘉偉，張盛清，高 明，鄭 立

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病預(yù)防協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）也被稱為退行性骨病，其臨床癥狀通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、活動受限等，嚴(yán)重甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和肌肉萎縮[1]。在臨床上，針對OA主要是緩解疼痛、減少畸形等對癥治療[2]。目前大量基礎(chǔ)研究的開展對OA的發(fā)生發(fā)展有了更近一步的認(rèn)識，但其具體發(fā)病機制仍不清楚。主要認(rèn)為OA 發(fā)病最重要的原因是活性氧（ROS）失衡[3]。因此，一種新型安全有效靶向ROS 失衡的藥物亟待被開發(fā)。納米酶是一種與蛋白質(zhì)類似具有酶活性的納米材料，Mil-88a 屬于金屬－有機骨架材料（MOFs）納米酶家族的一員，具有過氧化物酶模擬物活性和良好的生物相容性[4]，因此被認(rèn)為是清除ROS，促進(jìn)OA 修復(fù)，具有前景的納米酶修復(fù)系統(tǒng)。本研究探討Mil-88a 納米酶通過清除ROS 促進(jìn)OA 修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 動物 新生3～5 d 齡、體重約12 g 清潔級SD大鼠，來自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SYXK桂2020-0004，已取得廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 無水氯化鐵（FeCl3）（阿拉丁試劑有限公司，上海）；富馬酸（fumaric acid）（Sigma，美國）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海）；納米四氧化三鐵（Fe3O4）（上海麥克林生化科技有限公司，上海）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（Sigma，美國）；羥自由基檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞增殖－毒性檢測試劑盒（CCK-8）（賽國生物科技有限責(zé)任公司，廣州）；鈣黃綠素（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）（Sigma，美國）；過氧化氫（H2O2）（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；組織細(xì)胞RNA 小量提取試劑盒（Magon，美國）；95%乙醇（廣西博恒醫(yī)療用品有限公司）；抗體白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（博士德生物工程有限公司，美國）；山羊血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，美國）；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（卡邁舒生物科技有限公司，中國）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 掃描電子顯微鏡、X 射線多粉末衍射儀（XRD）（Rigaku，美國）；熱重分析儀（林賽斯上海科學(xué)儀器有限公司）；納米粒度及Zeta 電位分析儀（Zetasizer Nano ZS，中國）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；梯度PCR儀、定量PCR儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；真空離心濃縮儀、多功能臺式告訴冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Mili-Q 純水機（廣西南寧市博美生物科技有限公司）；傅里葉紅外光譜儀、熒光成像分析系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.2 材料合成

Mil-88a 的制備過程在已有文獻(xiàn)的技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)。首先，稱取0.974 4 g（8.4 mmoL）富馬酸與2.272 2 g（8.4 mmoL）Fecl3，即n（富馬酸/FeCl3）=1∶1。將上述物質(zhì)溶解于42 mL 的超純水中后，經(jīng)過1～2 h 的攪拌，轉(zhuǎn)移到100 mL 的內(nèi)襯聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放置在鼓風(fēng)干燥箱中，在85 ℃下反應(yīng)2 h。2 h 后取出反應(yīng)釜，將反應(yīng)釜置于室溫冷卻。待反應(yīng)釜冷卻后，將溶液在10 000 r/min條件下離心10 min得到磚紅色固體，隨后將其倒入燒杯中，用無水乙醇洗滌3 次，再次離心得到固體后，放入真空干燥箱在100 ℃干燥6 h，干燥所得固體即為所述的金屬有機骨架Mil-88a，并留作備用。

1.3 Mil-88a的表征

將上述干燥的材料，取一部分粉末分別用于SEM、XRD、TGA、FTIR 表征，另取少量粉末超聲分散于超純水中，用于粒度分析和ZETA電位測量。

1.4 Mil-88a的SOD清除率檢測

利用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生超氧陰離子的原理，按照試劑盒說明書，分別配置WST 工作液和酶工作液。另取一定量的樣品粉末配制成一定濃度的母液，在1.5 mL EP 管內(nèi)與純水按不同比例混合得到不同濃度的樣品溶液，先后加入一定量的WST 工作液與酶工作液，充分混勻后于37 ℃下孵育20 min，充分離心去除材料后測量上清液450 nm處吸光值并與對照組進(jìn)行比較和計算，每組重復(fù)3次。

1.5 Mil-88a的羥自由基清除率檢測

利用芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，羥自由基與顯色劑互相作用的原理，按試劑盒說明書配制不同濃度的Mil-88a 溶液，測量不同濃度下Mil-88a 的羥自由基清除效率，每組重復(fù)3次。

1.6 軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)

軟骨組織從5 d 齡的SD 大鼠分離，用含10%雙抗的PBS 沖洗去除血塊。在37 ℃，用0.25%胰蛋白酶孵育消化1.5 h 后，更換0.02%Ⅱ型膠原酶消化過夜，分離出游離細(xì)胞。待游離細(xì)胞貼壁后，每兩天更換一次培養(yǎng)基，傳至P3～P5代使用。

1.7 生物相容性檢測

（1）CCK-8法：將100 μL 5×104/mL P3～P5軟骨細(xì)胞接種于96 孔板中過夜，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基分別加入100 μL 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL，10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL培養(yǎng)基重懸的Mil-88a。繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后徹底移除培養(yǎng)基，PBS沖洗兩遍徹底去除材料，加入按1∶10 配置好的含培養(yǎng)基的CCK-8 110 μL，在37 ℃下培養(yǎng)1 h。孵育完成后小心吸取上清培養(yǎng)基移至新的96 孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀測量450 nm 處吸光度。每組重復(fù)3 次。（2）細(xì)胞活死染色：將5 000 個P3～P5 軟骨細(xì)胞接種于96 孔板中過夜，待貼壁后更換1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL Mil-88a共孵育24 h后，去除培養(yǎng)基PBS 沖洗2 次。100 μL Calcein-AM/PI 染色工作液被加入避光培養(yǎng)20 min，PBS去除多余染料，在共聚焦顯微鏡100倍下隨機選取3視野觀察。

1.8 PCR檢測

將每孔30×104/mL 細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后去除舊培養(yǎng)基并用PBS 徹底沖洗，隨后加入濃度為450 μmol/L 用無血清培養(yǎng)基配制的H2O2誘導(dǎo)液1 mL，充分誘導(dǎo)細(xì)胞后加入等體積的不同濃度的無血清培養(yǎng)基配制的Mli-88a 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后PBS 徹底沖洗去除材料與培養(yǎng)基，提取RNA用于PCR實驗。各引物序列,見表1。

表1 PCR的引物序列

1.9 免疫熒光

每孔種植75000個同代軟骨細(xì)胞于已放置爬片的24孔板中，貼壁過夜后用0.25 mL混有H2O2的無血清培養(yǎng)基37 ℃下對細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激誘導(dǎo)20 min 后，加入濃度分別為1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL Mil-88a 和培養(yǎng)基混合和溶液0.25 mL，再孵育24 h后，用PBS 緩沖液清洗3 次細(xì)胞，4%多聚甲醛固定25 min，再用PBS 清洗3 次，然后加入3%的H2O2孵育15 min，PBS 清洗3 次，再與山羊血清一同孵育30 min。封閉處理之后，將稀釋后的IL-1β 的一抗（1∶200），滴加在爬片上，4 ℃冰箱過夜孵育。隨后，用生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500）和稀釋液孵育1 h。最后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核，黑暗條件下孵育10 min，緩沖液清洗3次后，吸走爬片上的水分，用中性樹脂封片后，通過熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。多組間比較采用ANOVA 單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡

電鏡顯示合成的Mil-88a呈六角桿狀，見圖1。

圖1 Mil-88a電鏡圖

2.2 XRD表征

Mil-88a 在整個圖譜中整體主峰并未出現(xiàn)較大偏移。在6°～15°中出現(xiàn)3 個特征峰，分別是2.8°、10.4°和12.9°，見圖2。

2.3 TGA與FTIR表征

Mil-88a 在100 ℃至300 ℃范圍中，質(zhì)量保持率基本不變。FTIR 顯示Mil-88a 具有FeCl3與富馬酸所有特征峰，見圖3。

圖2 XRD表征

圖3 TGA與FTIR表征

2.4 Mil-88a的生物相容性評價

2.4.1 CCK-8 法 當(dāng)Mil-88a 濃度在1～10 μg/mL時，軟骨細(xì)胞存活率維持在80%以上，見圖4。

圖4 Mil-88a不同濃度干預(yù)24 h軟骨細(xì)胞增殖影響

2.4.2 細(xì)胞活死染色 當(dāng)濃度大于10 μg/mL時，對軟骨細(xì)胞表現(xiàn)較強的毒性（P＜0.001），見圖5。

2.5 Mil-88a的ROS清除作用

伴隨著Mil-88a 濃度升高，Mil-88a 的SOD 清除率逐漸升高（P＜0.001），羥自由基清除率與Fe3O4相比具有差異，但清除效率不隨Mil-88a 改變（P＜0.05），見圖6。

2.6 PCR 檢測IL-1β、TNF-α、SOD1、SOD2 表達(dá)情況

Mil-88a濃度依賴性下調(diào)IL-1β、SOD1、SOD2的表達(dá)（均P＜0.05）。TNF-α 的表達(dá)下降（P＜0.05），但是不隨Mil-88a濃度改變，見圖7。

2.7 免疫熒光染色

H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞IL-1β 表達(dá)隨著Mil-88a 濃度上升逐漸下降，見圖8。

圖5 Calcein-AM/PI染色檢測Mil-88a不同濃度干預(yù)24h軟骨細(xì)胞活死影響

圖6 Mil-88a不同濃度24 h對SOD、OH清除率影響

圖7 Mil-88a對軟骨細(xì)胞IL-1β、TNF-α、SOD1、SOD2表達(dá)影響

圖8 免疫熒光染色觀察不同濃度下IL-1β表達(dá)情況

3 討論

在中國大約有16.2%患者長期遭受OA的困擾，難以忍受的疼痛與極高致殘率嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，破壞影響家庭社會的穩(wěn)定[5]。雖然進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，目前對OA 的病因和發(fā)病機制尚無定論，主要認(rèn)為與年齡、職業(yè)、勞損和內(nèi)分泌等因素有關(guān)[6-7]，其中過量的ROS是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎炎性病變的重要因素之一，作為治療OA的潛在靶點，如何逆轉(zhuǎn)ROS失衡已經(jīng)成為治愈OA的關(guān)鍵[8]。

MOFs是一種由金屬節(jié)點和有機配體通過化學(xué)鍵自組裝形成具有特殊3D 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米粒子。具有比表面積大，可調(diào)節(jié)的孔徑，穩(wěn)定的物化性質(zhì)被認(rèn)為具有前景的仿生納米酶[9]。Wu 等[10]報道MOFs 的特殊金屬節(jié)點結(jié)構(gòu)具有氧化酶類似物活性，被認(rèn)為清除ROS 的理想納米酶。在本研究中，Mil-88a 電鏡顯示呈六角桿狀，XRD 在6°～15°出現(xiàn)3個特征峰與先前報道吻合[11]。FTIR具有所有原材料特征峰，TGA證實在100～300 ℃左右Mil-88a仍具有良好的穩(wěn)定性。為了驗證Mil-88a 的細(xì)胞毒性，CCK-8 與活死染色提示當(dāng)Mil-88a 濃度小于10 μg/mL 時基本沒有細(xì)胞毒性（P＜0.001）?？偠灾琈il-88a成功被合成且具有良好的生物相容性。

OA 主要表現(xiàn)為軟骨的缺損，減輕軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激與清除過量活性氧的產(chǎn)生將有利于軟骨的再生[12-13]，ROS包括SOD和OH等[14]。進(jìn)一步驗證Mil-88a的ROS清除率，結(jié)果顯示，Mil-88對SOD清除率程濃度依賴性（P＜0.001），OH清除率不隨濃度改變但仍高于Fe3O4（P＜0.05），提示可能并不是單單歸結(jié)于其多孔物理結(jié)構(gòu)清除ROS，具體機制仍有待進(jìn)一步研究。結(jié)局表明，Mil-88a具有作為清除關(guān)節(jié)腔ROS納米酶的潛力。

ROS作為調(diào)控炎癥的重要信號分子，ROS的失衡導(dǎo)致TNF-α 與IL-1β 炎癥因子的異常表達(dá)，先前文獻(xiàn)報道TNF-α與IL-1β與軟骨破壞與滑膜炎的發(fā)生密切相關(guān)[15-17]，TNF-α作為軟骨膠原生成關(guān)鍵性抑制劑，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，TNF-α的激活通過上調(diào)IL-1β的炎癥扳機，引起炎癥級聯(lián)瀑布的發(fā)生[18]。在本研究中，伴隨著Mil-88a 濃度升高下調(diào)了軟骨細(xì)胞炎癥因子TNF-α的表達(dá)（P＜0.001），而IL-1β下調(diào)并不隨Mil-88a濃度改變（P＜0.001）。當(dāng)Mil-88a濃度大于20 μg/mL 時下調(diào)了軟骨細(xì)胞氧化因子SOD1、SOD2 的表達(dá)（P＜0.001），然而當(dāng)濃度大于20 μg/mL 時，SOD1、SOD2 基因的表達(dá)并沒有進(jìn)一步的下降。在免疫熒光中與PCR結(jié)果一致，Mil-88a下調(diào)H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞IL-1β炎癥因子的表達(dá)（P＜0.001）。

綜上所述，本研究成功合成了一種具有抗ROS酶活性的納米酶Mil-88a，具有良好的生物安全性，能夠下調(diào)H2O2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中氧化和炎癥因子的表達(dá)，下一步我們將在動物體內(nèi)治療關(guān)節(jié)炎癥其安全性和療效，并探明其清除ROS的潛在機制為臨床轉(zhuǎn)化提供可靠的實驗依據(jù)。