李利榮，李曉熙，劉殿甲，吳宇峰，關(guān)玉春，張肇元

(1.天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，天津 300191；2.南開大學(xué)人工智能學(xué)院，天津 300350)

液相色譜-大氣壓電離-離子阱質(zhì)譜(HPLC-API-IT-MS)最早用來進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析，Michal等[1]總結(jié)并解釋了HPLC-API-MSn技術(shù)分析帶有典型基團(tuán)的小分子化合物的基本碎裂規(guī)律。電噴霧離子源(ESI)技術(shù)的發(fā)展成功解決了HPLC和MS聯(lián)用的接口問題，使HPLC-MS逐漸發(fā)展為成熟的技術(shù)。該技術(shù)不僅適用于分析各種有機(jī)小分子化合物，還可以使生物聚合物、蛋白質(zhì)等不耐熱、極性大和高分子質(zhì)量的化合物電離并轉(zhuǎn)移到氣相，從而將其應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和植物代謝組學(xué)[2-4]等領(lǐng)域。Daniel等[5]研究了在ESI正、負(fù)離子模式下，某些典型合成產(chǎn)物和天然產(chǎn)物最常見的碎裂規(guī)律。2000年，俄羅斯科學(xué)家Makarov等[6-7]根據(jù)靜電場軌道阱技術(shù)提出了Orbitrap作為一種新型質(zhì)量分析器，其質(zhì)量精度<1×10-6，大幅提高了未知物確證的準(zhǔn)確度。近年來，采用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)結(jié)合碰撞池(HCD)或其他碎裂方法促進(jìn)化合物裂解進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的報(bào)道顯著增加[5]。

醛酮類羰基化合物(CC)是空氣中一類重要的環(huán)境污染物，是形成空氣中多種自由基、有機(jī)酸、臭氧、過氧?；跛狨?PAN)和二次有機(jī)氣溶膠(SOA)等污染的重要前體物，是光化學(xué)煙霧的主要成分[8-13]。測定環(huán)境介質(zhì)中CC的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和分光光度法(SP)等，而液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS或LC-MS/MS)在定性方面的優(yōu)勢大大提高了CC檢測的準(zhǔn)確性。Kolliker等[14-16]在大氣壓化學(xué)電離源(APCI)負(fù)離子模式下，通過離子阱質(zhì)譜法分析了部分羰基化合物腙衍生物(CC-DNPH)的碎片結(jié)構(gòu)，但受限于當(dāng)時(shí)儀器精度水平，部分碎片可能存在解析偏差。目前，Orbitrap高分辨質(zhì)譜優(yōu)異的質(zhì)量精度和超高分辨率為CC-DNPH的碎裂機(jī)理研究提供了可靠的基礎(chǔ)。

本文擬利用高效液相色譜-電噴霧-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(HPLC-ESI-Q-Orbitrap MS)對25種CC-DNPH的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，系統(tǒng)研究CC-DNPH的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，建立快速篩查數(shù)據(jù)庫，并將其用于環(huán)境空氣樣品的篩查及定量分析。根據(jù)裂解規(guī)律、母離子和子離子精確質(zhì)量，擴(kuò)展篩查其他可能存在的羰基化合物，希望為環(huán)境多種介質(zhì)中CC篩查檢測提供方法參考，為環(huán)境安全監(jiān)測、預(yù)警和執(zhí)法提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Ultimate 3000-Q Exactive Focus超高效液相色譜-電噴霧-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；Cleanert DNPH-Silica醛酮?dú)怏w采樣管(200 mg/3 mL)及臭氧去除管(240 mg/3 mL)：天津艾杰爾飛諾美公司產(chǎn)品；0.22 μm尼龍水相針式濾膜：美國Supelco公司產(chǎn)品。

1.2 材料與樣品

25種CC-DNPH標(biāo)準(zhǔn)溶液(15 mg/L)：美國ChemTek公司產(chǎn)品；2,4-二硝基苯肼(DNPH)：純度99.5%，百靈威公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，德國Merk公司產(chǎn)品；超純水：經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)純化制得。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件 Thermo Accucore RP-MS色譜柱(2.1 mm×100 mm×2.6 μm)；柱溫40 ℃；流動相：A為1 mmol/mol乙酸銨-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min(50%B)，8～15 min(50%～60%B)，15～20 min(60%～70%B)，20～24 min(70%～80%B)，24～25 min(80%～95%B)，25～28 min(95%B)，28～28.1 min(95%～50%B)，28.1～30 min(50%B)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 HESI電離源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管溫度325 ℃；離子源加熱溫度350 ℃；噴霧電壓2 800 V；透鏡電壓60 V；一級質(zhì)譜Full MS和平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)參數(shù)：分辨率70 000，最大容量(AGC target)1×106，最大駐留時(shí)間(maximum IT)100 ms，質(zhì)量掃描范圍m/z50～600；二級質(zhì)譜dd-MS2參數(shù)：分辨率17 500，歸一化碰撞能量(NCE)(45±20) V，最大容量2×105，最大駐留時(shí)間60 ms，動態(tài)排除8.0 s。

1.3.3數(shù)據(jù)處理 采用Trace Finder 3.3軟件處理數(shù)據(jù)。一級母離子精確相對分子質(zhì)量參數(shù)：峰強(qiáng)度閾值10 000，信噪比閾值5.0，質(zhì)荷比允許偏差5.00×10-6，保留時(shí)間允許偏移30 s；二級子離子參數(shù)：最少匹配數(shù)1個(gè)，峰強(qiáng)度閾值5 000，質(zhì)荷比允許偏差5.00×10-6。定量方法：基于目標(biāo)分析物的一級母離子峰面積，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1離子模式的選擇 實(shí)驗(yàn)比較了ESI正、負(fù)離子模式下Full MS-ddMS2的準(zhǔn)分子離子峰及其碎片離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下，25種CC-DNPH生成了高響應(yīng)值的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-；而在正離子模式下，雖然存在明顯的[M+H]+峰，但各目標(biāo)物的響應(yīng)值均較低。正、負(fù)離子模式下，300 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的母離子(準(zhǔn)分子離子峰)響應(yīng)值示于圖1?？梢?，負(fù)離子模式更適用于CC-DNPH的檢測。

注：FA.甲醛-DNPH；AA.乙醛-DNPH；ACR.丙烯醛-DNPH；AK.丙酮-DNPH；2-FA.糠醛-DNPH；PA.丙醛-DNPH； CA.丁烯醛-DNPH；BK.丁酮-DNPH；MA.甲基丙烯醛-DNPH；BA.丁醛-DNPH；BZA.苯甲醛-DNPH；IVA.異戊醛-DNPH； CHK.環(huán)己酮-DNPH；GA.戊二醛-DNPH；VA.戊醛-DNPH；TA.甲基苯甲醛-DNPH；MIBK.甲基異丁基酮-DNPH； HEXA.己醛-DNPH；DMBA.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH；HEPA.庚醛-DNPH；OA.辛醛-DNPH；NA.壬醛-DNPH；DA.癸醛-DNPH圖1 正、負(fù)離子模式下，CC-DNPH準(zhǔn)分子離子響應(yīng)豐度Fig.1 QMIs abundance of CC-DNPHs at positive and negative ion modes

2.1.2不同碰撞能量對碎片生成的影響 本實(shí)驗(yàn)檢測了在負(fù)離子模式下，NCE均值分別為20、30、40、45、50、60、80 V時(shí)，25種目標(biāo)物的母離子和子離子響應(yīng)。結(jié)果表明，在相同的碰撞能量下，飽和脂肪醛的母離子峰響應(yīng)均低于碎片離子，更容易碎裂，其他醛酮類(如芳香醛、不飽和脂肪醛以及酮類)母離子的響應(yīng)均較高，要達(dá)到相當(dāng)?shù)乃榱殉潭?，則需要更大的碰撞能量；同一種物質(zhì)在不同的碰撞能量下，[M-H]-及其碎片離子的相對響應(yīng)變化較大，能量越大，[M-H]-離子峰豐度越小。在NCE均值>30 V時(shí)，甲醛和戊二醛的母離子全部碎裂；NCE均值>50 V時(shí)，有將近一半化合物的母離子全部碎裂；NCE>70 V時(shí)，只有對-甲基苯甲醛、糠醛、壬醛和癸醛可見響應(yīng)非常低的母離子，其他全部碎裂。因此，本研究選擇甲醛和戊二醛NCE均值為30 V，其他醛酮類NCE均值為45 V對化合物進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。

2.2 化合物母離子和子離子信息

對25種濃度為150 μg/L 的CC-DNPH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以PRM方式獲得目標(biāo)物的保留時(shí)間、母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)等，建立快速篩查數(shù)據(jù)庫，具體信息列于附表1(請登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》官網(wǎng)http：∥www.jcmss.com.cn下載)。在優(yōu)化的色譜條件下，25種目標(biāo)物中只有對-甲基苯甲醛和間-甲基苯甲醛共流出，其他均可達(dá)到至少50%分離度，可以獲得準(zhǔn)確的目標(biāo)物信息。25種目標(biāo)物母離子及其子離子的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差均小于5×10-6，表明目標(biāo)物的質(zhì)量準(zhǔn)確度良好，可以滿足化合物結(jié)構(gòu)解析及篩查需求。典型的CC-DNPH二級質(zhì)譜圖示于圖2。

2.3 CC-DNPH結(jié)構(gòu)解析

通過分析2,4-DNPH和25種CC-DNPH母離子及其二級碎片離子，飽和脂肪醛與非飽和脂肪醛、脂肪醛與芳香醛、單羰基醛與二羰基醛及呋喃甲醛碎片離子存在較大差異，而m/z76[C5H2N]碎片離子存在于所有目標(biāo)物二級質(zhì)譜圖中，且分子質(zhì)量越小的化合物，m/z76相對響應(yīng)越高。如飽和脂肪醛中，甲醛相對響應(yīng)最高的碎片離子為m/z76，乙醛、丙醛和丁醛為m/z122，其他為m/z152。2,4-DNPH裂解碎片較獨(dú)特，基峰為m/z137，峰高其次為m/z167，相對響應(yīng)約為70%，這兩個(gè)離子在25種CC-DNPH碎片中均未發(fā)現(xiàn)，表明2,4-DNPH裂解路徑與CC-DNPH不同。甲醛與其他醛類的碎裂離子相差較大，如相對響應(yīng)較高的m/z133碎片離子只存在甲醛中，m/z120的相對響應(yīng)在甲醛碎片離子中較高，而在其他化合物離子碎片中較低。25種CC-DNPH除了響應(yīng)高的碎片離子，還有響應(yīng)不高但具有明顯中性丟失及特征碎片脫落的離子，如中性丟失18 u[H2O](丁醛、己醛和庚醛和酮)；具有相同脫落的特征碎片，如30 u[NO](除甲醛、丙烯醛和甲基丙烯醛外的脂肪醛和酮)、31 u[HNO](丙烯醛、丁烯醛和丙烯醛)、45 u[CH3+NO] (丁烯醛、甲基丙烯醛和己醛)、46 u[H2N2O](甲醛、乙醛和丙烯醛等)、47 u[HNO2](甲醛、丙烯醛和丙酮等)、59 u[HN3O](丙酮、丙烯醛和丁酮等)、60 u[N2O2](丙烯醛、丙酮和丁醛等)、65 u[H3NO3](丙烯醛和丁烯醛)、76 u[H2N3O2](甲醛和DNPH)、77 u[HN2O3](丙烯醛、丁烯醛和甲基丙烯醛等)、78 u[H2N2O3] (丁烯醛、丁酮和丁醛等)、93 u[H3N3O3](苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛)、165 u[C6H3N3O3](丙酮、丙烯醛、丁烯醛等)等。

注：a.2,4-硝基苯肼；b.甲醛-DNPH；c.丙酮-DNPH；d.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH圖2 負(fù)離子模式下，典型的CC-DNPHs二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra of typical CC-DNPHs at negative mode

此外，m/z163碎片結(jié)構(gòu)解析結(jié)果與文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的C7H5N3O2(精確質(zhì)量數(shù)為m/z163.038 18)不同，為C6H3N4O2(精確質(zhì)量數(shù)為m/z163.025 60)。某些中性丟失、裂解機(jī)理與文獻(xiàn)[17]報(bào)道不同，如25種目標(biāo)物和DNPH質(zhì)譜碎片中均未見m/z17[NH3]的中性丟失碎片，表明未發(fā)生完整的費(fèi)舍爾吲哚反應(yīng)。所有化合物m/z181碎片離子相對響應(yīng)均高于m/z182，近一半化合物質(zhì)譜圖中未發(fā)現(xiàn)明顯的m/z182碎片離子。根據(jù)25種[M-H]-碎片精確質(zhì)量數(shù)及其在二級質(zhì)譜圖中的相對響應(yīng)，推測主要碎片離子可能的結(jié)構(gòu)及碎裂過程，示于圖3。

2.3.12,4-二硝基苯肼裂解規(guī)律 2,4-DNPH的特征二級碎片離子為m/z137、167、179、138等，在其他CC-DNPH中的響應(yīng)都較低，甚至檢測不到，其可能的裂解規(guī)律示于圖4。

2.3.2飽和脂肪醛裂解規(guī)律 甲醛分子質(zhì)量相對較小，在相同的碎裂電壓下，碎片碎裂程度相對較高，主要碎片離子的分子質(zhì)量也較小，基峰為m/z76，其次為m/z133。特征碎片m/z133[C7H3NO2]-可能的裂解規(guī)律示于圖5。其他飽和脂肪醛遵循[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122和[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163的裂解規(guī)律，響應(yīng)最高的特征離子主要為m/z152、122、163等，大于等于5個(gè)碳的醛的腙衍生物分子質(zhì)量越大，m/z152相對豐度越高，分子質(zhì)量越小，m/z122豐度越高。大多數(shù)具有丟失30、60[N2O2]、165、59和78 u碎片，大于4個(gè)碳的醛的衍生物均帶有18 u中性丟失。

由于直鏈和支鏈醛或酮發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的活性不同，探究它們的碎裂規(guī)律具有重要意義，但直鏈和支鏈醛或酮的物理化學(xué)性質(zhì)相似，容易發(fā)生共流出。由于供研究的直鏈、支鏈目標(biāo)物數(shù)量較少，需要進(jìn)一步研究更多結(jié)構(gòu)以獲得豐富的信息。本研究涉及到的直鏈和支鏈醛為戊醛/異戊醛、丁烯醛/甲基丙烯醛，在優(yōu)化的色譜條件下均能實(shí)現(xiàn)分離。戊烷和異戊醛具有非常相似的裂解規(guī)律。甲基丙烯醛和丁烯醛碎片差異較大，雖然二者基峰均為準(zhǔn)分子離子峰，但甲基丙烯醛具有相對響應(yīng)約50%的m/z79[C4H3N2]-峰，而丁烯醛沒有，這可能是由于甲基丙烯基和2個(gè)N從母離子上碎裂下來后，發(fā)生了分子重排而生成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；丁烯醛有較高豐度的m/z181碎片，相對響應(yīng)約70%，而甲基丙烯醛m/z181碎片峰的豐度則低于m/z79和163，約為40%。根據(jù)丁烯醛和甲基丙烯醛m/z205[C10H9N2O3]-碎片的精確質(zhì)量數(shù)60，推斷碎片丟失不應(yīng)為[N2O2]，而是[CH4N2O]，丁醛存在類似的裂解規(guī)律。

2.3.3不飽和醛裂解規(guī)律 不飽和醛包括丙烯醛、丁烯醛、甲基丙烯醛等3種脂肪醛和以糠醛為代表的呋喃醛。在碰撞能量45 V下，丙烯醛和糠醛的母離子響應(yīng)均較高，一般為基峰，說明在相同的碰撞能量下不飽和醛比飽和醛更難碎裂。碎片離子中，m/z152和122比m/z163、181、76、179豐度低，表明存在[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122、[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163以及[M-H]-→m/z181的裂解路徑，且[M-H]-→m/z122的碎裂發(fā)生相對較少。不飽和醛均未發(fā)現(xiàn)18和30 u的碎片丟失?？啡┲槐憩F(xiàn)47 u的碎片丟失，其他3種醛存在31和47 u的碎片丟失。此外，丙烯醛還存在46、60、65和77 u的碎片丟失，丁烯醛和甲基丙烯醛均存在45和165 u的碎片丟失，甲基丙烯醛存在77 u的碎片丟失，丁烯醛存在46、65、78 u的碎片丟失。

圖3 CC-DNPH母離子形成示意圖(a)和主要碎片可能的離子結(jié)構(gòu)及形成過程示意圖(b)Fig.3 Schematic of [M-H]- of CC-DNPHs (a) and main possible fragment structures and fragmentation pathways of CC-DNPHs (b)

圖4 2,4-DNPH主要碎片離子結(jié)構(gòu)及形成過程示意圖Fig.4 Main fragment structures and fragmentation pathways of 2,4-DNPH

圖5 甲醛-DNPH m/z 133碎片結(jié)構(gòu)及形成過程示意圖Fig.5 Structure and fragmentation pathway of m/z 133 of formaldehyde-DNPH

2.3.4芳香醛裂解規(guī)律 本研究的芳香醛包括苯甲醛、甲基苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛。芳香醛均含有較高豐度m/z181、163、76、120、122、151、135、105以及48 u[H2NO2]丟失的碎片。77、93和165 u碎片丟失的離子在苯甲醛中有中等強(qiáng)度的相對響應(yīng)。芳香醛均含有特征碎片m/z164[C6H3N3O3]-、m/z104[C7H6N]-及中性丟失28 u[N2]，但相對響應(yīng)均不足10%。N2丟失的可能裂解規(guī)律示于圖6。m/z121碎片在苯甲醛中的相對響應(yīng)約為70%，在甲基苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛中的相對響應(yīng)不足10%。m/z148僅存在于2,5-二甲基苯甲醛碎片中，其他兩種化合物不含該碎片。

2.3.5酮裂解規(guī)律 酮包括丙酮、丁酮、環(huán)己酮和甲基異丁基酮。所有酮-DNPH的質(zhì)譜圖中均含有[M-H-H2O]-和[M-H-NO]-峰，即均有18和30 u丟失碎片，其中30 u丟失碎片響應(yīng)較高，但相同分子質(zhì)量的醛m/z30碎片響應(yīng)則相對較低。酮-DNPH與其同分異構(gòu)體的醛-DNPH相比，酮-DNPH有較高豐度的m/z122、152、178峰，缺少或雖含有但相對響應(yīng)低于5%的m/z163峰。丁酮、環(huán)己酮和甲基異丁基酮含有m/z76和181碎片峰，但相對響應(yīng)均低于10%。表明[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122和m/z178的生成過程為主要裂解路徑。丙酮、丁酮和甲基異丁基酮均存在m/z178[C9H8NO3]-特征碎片。m/z178可能發(fā)生的碎裂過程示于圖7。

2.3.6二醛和呋喃醛裂解規(guī)律 二醛和呋喃醛包括戊二醛和糠醛(2-呋喃甲醛)。戊二醛結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，在NCE平均值為30 V時(shí)，戊二醛母離子的相對響應(yīng)約為基峰m/z182[C6H4N3O4]-的75%；當(dāng)CE為40 V時(shí)，不存在母離子，質(zhì)荷比最大的子離子為m/z279[C11H11N4O5]-碎片，其次為m/z163、122、152、76、197、233和179等碎片離子。m/z197和179在其他24種目標(biāo)物中均響應(yīng)極低或未發(fā)現(xiàn)，而在DNPH中明顯存在。

R=aromatics, furan, naphthenic圖6 芳香醛N2中性碎片丟失過程示意圖Fig.6 Schematic diagram of N2 neutral debris loss process of aromatic aldehydes

圖7 m/z 178碎片結(jié)構(gòu)及形成過程示意圖Fig.7 Structure and fragmentation pathway of m/z 178

糠醛中僅發(fā)現(xiàn)47 u[HNO2] 碎片離子，且相對響應(yīng)約為50%。m/z182相對響應(yīng)約為m/z181的80%，而其他24種目標(biāo)物碎片中m/z182相對響應(yīng)均較低?？啡┧槠兄饕槠x子相對響應(yīng)從高到低依次為m/z76、181、163、228、182、151等，表明糠醛-DNPH較易碎裂，主要碎裂路徑為[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163、[M-H]-→m/z181→m/z151以及[M-H]-→m/z182。

2.4 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法分析分別于2020年1月27日、3月9日、3月15日、3月21日、3月27日在天津市區(qū)采集的5個(gè)環(huán)境空氣樣品，針對25種羰基化合物進(jìn)行定性和定量測定。結(jié)果表明，在5個(gè)實(shí)際樣品中，除戊二醛外，其他24種目標(biāo)物的平均濃度在0.006～4.45 μg/m3之間。

對5個(gè)樣品中13種其他可能存在的非靶標(biāo)羰基化合物進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)m/z152、122、163等主要碎片離子遵循與解析結(jié)果相似的裂解規(guī)律。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似化合物的響應(yīng)因子，推測12種陽性化合物(4′-甲氧基苯乙酮篩查結(jié)果為陰性)的半定量濃度在0.007～4.18 μg/m3之間，其中2-壬酮濃度最高，其次為十二醛、十三醛和十一醛，均大于1.0 μg/m3。12種陽性化合物的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、子離子及半定量結(jié)果列于表1。

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法解析了25種CC-DNPH的質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡述了飽和脂肪醛、不飽和脂肪醛、芳香醛、二羰基醛和酮等DNPH衍生物在二級質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，并建立了可用于準(zhǔn)確定性的篩查質(zhì)譜庫。將本方法用于5種實(shí)際樣品的檢測，并擴(kuò)展篩查了13種其他可能存在的羰基化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似化合物的響應(yīng)因子，推測了12種陽性化合物的半定量結(jié)果。本研究可為小分子極性化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律解析提供借鑒。