黃飛飛，王 榮，陳 玥，沈愛(ài)金， 劉艷芳，梁鑫淼，金紅利，閻 松

(1.大連交通大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116028； 2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所分離分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

夏天無(wú)為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.) Pers.的干燥塊莖，又名一粒金丹、洞里神仙、伏地延胡索等，廣泛分布于湖南、江西、福建、安徽、浙江等省份[1]，是一種民間常用草藥，常用于治療高血壓、中風(fēng)偏癱，跌撲損傷。研究表明，夏天無(wú)的主要有效成分是生物堿，具有抗炎、抗心律失常、改善視力、鎮(zhèn)痛等作用，臨床上對(duì)腦梗塞、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛等有確切療效[2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從夏天無(wú)塊莖中分離出約40個(gè)生物堿[3-5]，均為異喹啉類生物堿，包括原小檗堿類、四氫原小檗堿類、普羅托品類、阿樸啡類、芐基異喹啉類和苯酞異喹啉類等，但尚未見(jiàn)對(duì)夏天無(wú)提物中生物堿的系統(tǒng)性鑒定研究。

目前，對(duì)夏天無(wú)中化學(xué)成分的研究?jī)H限于傳統(tǒng)的分離手段和半制備色譜法等。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法與傳統(tǒng)方法相比，具有高分辨、高靈敏度，適用于檢測(cè)未知化合物等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于每個(gè)化合物信號(hào)都會(huì)產(chǎn)生一張譜圖，1次進(jìn)樣可產(chǎn)生上千乃至上萬(wàn)張譜圖，給人工解譜帶來(lái)困難。分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)(molecular networking, MN)可以直觀地觀測(cè)到測(cè)試樣品中所有能夠檢測(cè)到的化合物分子離子，具有類似構(gòu)造的天然產(chǎn)物分子在相同的質(zhì)譜分離條件下會(huì)產(chǎn)生相似的質(zhì)譜碎片離子，計(jì)算機(jī)根據(jù)系統(tǒng)的算法對(duì)二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行相似度計(jì)算，并依據(jù)相似度的高低，整合為一種可視化的網(wǎng)絡(luò)圖譜[6-7]，該技術(shù)對(duì)于不同平臺(tái)的質(zhì)譜儀器產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)具有較大的兼容性。

基于LC-MS/MS數(shù)據(jù)的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，但在中藥領(lǐng)域的研究報(bào)道卻十分有限。Paz等[8]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRESI MS/MS)技術(shù)和基于分子網(wǎng)絡(luò)的分析指導(dǎo)，排除24個(gè)已知化合物，從蘇里南杜氏藻(Duguetiasurinamensis)中分離出11個(gè)新生物堿，包括2個(gè)新骨架化合物。de Oliveira 等[9]基于碰撞誘導(dǎo)解離模式的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-CID MS/MS)與分子網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合使用，從馬西米蘭帝王腺萼(Adenocalymmaimperatoris-maximilianii)提取物中鑒定出63個(gè)化合物，主要為黃酮苷類，還首次鑒定到含異戊二烯基的黃酮衍生物。

本研究擬采用基于高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS/MS)的分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，通過(guò)將碎片離子可視化，清晰地展現(xiàn)碎片離子的聚集與分布，直觀地尋找各分子之間的相互聯(lián)系，加快鑒定夏天無(wú)中的化學(xué)成分，希望為后期分離純化和闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 1290 infinity高效液相色譜儀、6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)；MS204TS電子分析天平：美國(guó)梅特勒-托利多有限公司產(chǎn)品；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

夏天無(wú)：產(chǎn)自湖南，安國(guó)市同德中藥材有限公司產(chǎn)品，經(jīng)大連化物所高級(jí)工程師楊小平鑒定為Corydalisdecumbens(Thunb.) Pers.的干燥塊莖；小檗堿、四氫巴馬汀、原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；比枯枯靈：上海吉至生化科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲醇：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)所用試劑及超純水均為質(zhì)譜級(jí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品溶液的制備 取約2 g夏天無(wú)藥材粉末，過(guò)3號(hào)篩，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待用。

1.3.2對(duì)照品溶液的制備 稱取適量的小檗堿、四氫巴馬汀、原阿片堿和比枯枯靈對(duì)照品，加入適量的甲醇，超聲溶解，于4 ℃避光保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：Waters-Acchrom-Tnature C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5%甲酸水溶液；洗脫條件：0～10 min(5%～10%A)，10～50 min(10%～20%A)，50～55 min(20%～50%A)，55～70 min(50%～90%A)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子模式，氣簾氣壓強(qiáng)2.41×105Pa，霧化氣壓強(qiáng)3.45×107Pa，干燥氣壓強(qiáng)3.45×107Pa，霧化溫度350 ℃，干燥氣流速8 L/min，離子化壓力3 500 V，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200，裂解電壓75 V，碰撞能40 eV。

1.4.3GNPS分子網(wǎng)絡(luò)分析條件 分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)既可在線通過(guò)GNPS平臺(tái)得到，也可離線通過(guò)軟件Cytoscape得到[10]。1) 使用ReifycsAbfConventor軟件(https:∥www.reifycs.com/AbfConverter/)將原始的LC-MS/MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為AnalysisBaseFile(abf)格式；2) 將轉(zhuǎn)換格式后的數(shù)據(jù)通過(guò)MS-DIAL (http:∥prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/)處理，MS/MS閾值設(shè)置為10，MS1和MS2質(zhì)量偏差分別設(shè)置為0.01、0.025 u；3) 將MS-DIAL生成的特征量化表(txt文件)和MS/MS光譜(mgf文件)上傳至GNPS(http:∥gnps.ucsd.edu)生成分子網(wǎng)絡(luò)，余弦分?jǐn)?shù)閾值設(shè)置為0.7，最小匹配碎片離子為6，topK設(shè)置為10，母離子之間的最大質(zhì)量偏差為500 u；4) 運(yùn)用Cytoscape軟件使分析結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)1.4.3節(jié)創(chuàng)建的分子網(wǎng)絡(luò)，在GNPS中匹配10種化合物。結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，提取已知化合物，匹配化合物的結(jié)構(gòu)需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品或文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行驗(yàn)證，排除假陽(yáng)性結(jié)果。再根據(jù)每個(gè)化合物簇中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性，通過(guò)文獻(xiàn)信息與質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測(cè)與已知化合物結(jié)構(gòu)相似的類似物或其他未知物，與GNPS沒(méi)有匹配到的化合物類型根據(jù)文獻(xiàn)信息手動(dòng)解析。

夏天無(wú)75%乙醇提取物的總離子流圖示于圖1，構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)圖示于圖2?；诜肿泳W(wǎng)絡(luò)中已匹配的化合物類型，初步判斷4個(gè)已知化合物類型的粒子簇，再結(jié)合質(zhì)譜信息，確定3個(gè)未知化合物類型的粒子簇，包括E簇、F簇和G簇。最終識(shí)別出52個(gè)生物堿，推斷出31個(gè)生物堿結(jié)構(gòu)，其特征性二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。

圖1 夏天無(wú)75%乙醇提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 75% ethanol extract from the rhizomes of Corydalis decumbens

注：a.普羅托品類；b.原小檗堿類；c.四氫小檗堿類；d.苯酞異喹啉類；e.簡(jiǎn)單異喹啉類；f.阿樸啡類；g.芐基異喹啉類圖2 分子網(wǎng)絡(luò)可視化圖譜Fig.2 Visualization map of molecular network

表1 夏天無(wú)生物堿二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 MS/MS data of alkaloids in the rhizomes of Corydalis decumbens

續(xù)表1

2.1 已知化合物簇的鑒定

2.1.1普羅托品類生物堿 根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中已經(jīng)匹配的化合物別隱品堿(化合物38)，初步判斷A簇為普羅托品類生物堿。此類生物堿不存在大π共軛系統(tǒng)，易發(fā)生RDA裂解，當(dāng)R1、R2位置分別具有2個(gè)甲氧基、亞甲二氧基、甲氧基和羥基時(shí)，其特征碎片分別為m/z222、206、208，裂解后的碎片會(huì)繼續(xù)失去一些小分子片段；另一個(gè)裂解特征是母核容易失去1分子H2O形成閉合四元環(huán)[11]。提取A簇中每個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較保留時(shí)間、母離子質(zhì)量和相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，排除具有相似碎片的非生物堿及重復(fù)峰，共鑒定出18種化合物為普羅托品類生物堿。以化合物31、37、38、42為例，詳細(xì)闡明此類生物堿的鑒定過(guò)程。

分子網(wǎng)絡(luò)中，別隱品堿的準(zhǔn)分子離子為m/z370.169 7，分子式為C21H23NO5，其高能通道質(zhì)譜的碎片離子m/z336[M+H-H2O-CH4]+、m/z206[M+H-C10H12O2]+、m/z188[M+H-C10H12O2-H2O]+和m/z189[M+H-C10H12O2-H2O-OH]+等與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，推測(cè)化合物38為別隱品堿。化合物31、37、42的準(zhǔn)分子離子為m/z354.146 4、386.194 3、384.143 7，它們的結(jié)構(gòu)式?jīng)]有與GNPS匹配?；衔?1的二級(jí)質(zhì)譜中，m/z206、149為發(fā)生RDA裂解的碎片，相對(duì)豐度最高的碎片m/z188、189是通過(guò)RDA裂解后進(jìn)一步脫水和脫羥基產(chǎn)生的，碎片m/z336[M+H-H2O]+、m/z308[M+H-H2O-CO]+、m/z275[M+H-H2O-CO-CH7N]+、m/z247[M+H-H2O-CO-CH7N-CO]+與標(biāo)準(zhǔn)品的碎片信息相同，參考文獻(xiàn)[12]，推測(cè)化合物31為原阿片堿?；衔?2與31的分子式相同，具有部分相似的特征碎片，推斷為原阿片堿的同分異構(gòu)體?；衔?7和42具有豐度較高的m/z222、206，推測(cè)在R1、R2位置分別具有2個(gè)甲氧基和亞甲二氧基，結(jié)合文獻(xiàn)[13]，推測(cè)其分別為隱品巴馬汀和紫堇維定。原阿片堿的質(zhì)譜圖和普羅托品類生物堿可能的裂解途徑示于圖3。

圖3 原阿片堿質(zhì)譜圖(a)和普羅托品類生物堿可能的裂解途徑(b)Fig.3 MS spectrum of protopine (a) and possible fragmentation pathways of protopine-type alkaloids (b)

2.1.2原小檗堿類生物堿 根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中已經(jīng)匹配的化合物藥根堿(化合物43)、小檗堿(化合物49)和巴馬汀(化合物50)，初步判斷B簇為原小檗堿類生物堿。此類生物堿的母核一般不會(huì)發(fā)生裂解，主要是小分子取代基的裂解與丟失，很少存在低于m/z200的產(chǎn)物離子。當(dāng)取代基包含2個(gè)或多個(gè)甲氧基時(shí)，特征碎片離子為[M-CH4]+、[M-CH3]+和[M-2CH3]+；當(dāng)取代基包含亞甲二氧基時(shí)，特征碎片離子為[M-CH2O]+；當(dāng)取代基包含羥基時(shí)，易產(chǎn)生失去1分子水的碎片離子。提取B簇中每個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較保留時(shí)間、母離子質(zhì)量和相關(guān)文獻(xiàn)[11,14]，共鑒定出6種化合物，全部為原小檗堿類生物堿。以化合物43、49、51為例，詳細(xì)闡明此類生物堿的鑒定過(guò)程。

分子網(wǎng)絡(luò)中，小檗堿的分子離子為m/z336.122 4，分子式為C20H18NO4+，其碎片離子有m/z320[M-CH4]+和m/z292[M-CH4-CO]+，表明該化合物存在相鄰的甲氧基；碎片離子m/z306[M-CH2O]+和m/z278[M-CH2O-CO]+，表明該化合物存在1個(gè)亞甲二氧基。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品碎片信息，參考文獻(xiàn)[14]，確定化合物49為小檗堿。藥根堿的準(zhǔn)分子離子為m/z338.137 7，特征碎片離子為m/z322[M-CH4]+、m/z294[M-CH4-CO]+和m/z320[M-H2O]+，表明該化合物含有鄰甲氧基和羥基，參考文獻(xiàn)[14]，確定化合物43為藥根堿?；衔?1的準(zhǔn)分子離子為m/z366.169 9，沒(méi)有在GNPS中匹配，碎片離子為m/z350[M-CH4]+、m/z351[M-CH3]+和m/z336[M-2CH3]+，推測(cè)該化合物存在2個(gè)鄰甲氧基，結(jié)合母離子質(zhì)量，說(shuō)明C13位置含有1個(gè)甲基，故推測(cè)該化合物為二氫巴馬汀。小檗堿的質(zhì)譜圖和原小檗堿類生物堿可能的裂解途徑示于圖4。

2.1.3四氫原小檗堿類生物堿 根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中已經(jīng)匹配的化合物延胡索單酚堿(化合物27)、金黃紫堇堿(化合物20)、四氫巴馬汀(化合物40)和氫化小檗堿(化合物44)，初步判斷C簇為原小檗堿類生物堿。此類生物堿C環(huán)結(jié)構(gòu)已飽和，在質(zhì)譜中易發(fā)生RDA裂解并繼續(xù)丟失一些取代基，或發(fā)生B環(huán)斷裂，很少存在質(zhì)荷比高于m/z200的產(chǎn)物離子。RDA裂解產(chǎn)生高豐度的含氮片段，作為四氫小檗堿型生物堿的特征片段，特征離子與R1和R2位置的取代基類型有關(guān)。當(dāng)R1和R2位置分別具有2個(gè)甲氧基、亞甲二氧基、1個(gè)甲氧基和1個(gè)羥基時(shí)，特征離子分別為m/z192、176、178。提取C簇中每個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)出4個(gè)沒(méi)有在GNPS中匹配的化合物結(jié)構(gòu)。

C簇中，m/z357.193 0[M+H]+、m/z342.179 0[M+H]+、m/z342.168 6[M+H]+、m/z354.132 2[M+H]+、m/z340.154 7[M+H]+沒(méi)有在GNPS中匹配，其中m/z357.193 0[M+H]+是有相似特征碎片的非生物堿。m/z342.179 0[M+H]+和m/z342.168 6[M+H]+的分子式為C20H23NO4。前者含有高豐度的含氮碎片m/z178，存在1個(gè)甲氧基和1個(gè)羥基，參考文獻(xiàn)[15]，推測(cè)其為四氫非洲防己堿(化合物28)；后者含有高豐度的碎片m/z192，說(shuō)明其存在鄰甲氧基，參考文獻(xiàn)[16]，推測(cè)其為紫堇達(dá)明堿(化合物24)。按照類似方法，推測(cè)m/z340.154 7[M+H]+為氫化小檗堿。m/z354.132 2[M+H]+比四氫小檗堿低2 u，產(chǎn)生高豐度的碎片離子m/z190[M+H-C10H12O2]+、m/z188[M+H-C10H14O2-CH3]+和m/z160[M+H-C10H10O2-CH3OH]+，所推測(cè)的化學(xué)結(jié)構(gòu)在Scifinder、Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有顯示，其為潛在的新化合物。四氫巴馬汀的質(zhì)譜圖和四氫原小檗堿類生物堿可能的裂解途徑示于圖5。

圖4 小檗堿質(zhì)譜圖(a)和原小檗堿類生物堿可能的裂解途徑(b)Fig.4 MS spectrum of berberine (a) and possible fragmentation pathways of protoberberine-type alkaloids (b)

2.1.4苯酞異喹啉類生物堿 根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中已經(jīng)匹配的化合物比枯枯靈(化合物22)，初步推斷D簇為苯酞異喹啉類生物堿。此類生物堿很少報(bào)道，以比枯枯靈為對(duì)照品，其二級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰為m/z368.118 7[M+H]+，產(chǎn)生m/z307[M+H-CH3NH2-CH2O]+碎片離子，接著失去1分子CH2O和CO，產(chǎn)生m/z277[M+H-CH3NH2-(CH2O)2]+和m/z249[M+H-CH3NH2-(CH2O)2-CO]+碎片離子。其中，m/z277、249的豐度較高，是該化合物的特征碎片離子，m/z190為母核裂解產(chǎn)生的碎片離子?；衔?2的二級(jí)質(zhì)譜碎片與對(duì)照品相似，參考文獻(xiàn)[17]，確定其為比枯枯靈。

D簇中，其余3個(gè)化合物m/z368.112 7[M+H]+、m/z370.129 0[M+H]+、m/z384.143 1[M+H]+的結(jié)構(gòu)沒(méi)有在GNPS中匹配，由于都含有碎片m/z190，說(shuō)明R1和R2位置均是亞甲二氧基，其中m/z368.112 7[M+H]+(化合物17)與比枯枯靈互為同分異構(gòu)體，但它們產(chǎn)生的碎片略有不同，可能是因?yàn)?個(gè)氫原子的構(gòu)象不同。由于CH3NH2、CH2O和H2分子的連續(xù)丟失以及鍵的裂解，化合物17產(chǎn)生m/z275[M+H-CH3NH2-2CH2O-H2]+碎片離子，接著失去1分子CO，產(chǎn)生m/z247[M+H-CH3NH2-2CH2O-H2-CO]+碎片離子，參考文獻(xiàn)[18]，推測(cè)化合物17為夏無(wú)堿。

圖5 四氫巴馬汀質(zhì)譜圖(a)和四氫原小檗堿類生物堿可能的裂解途徑(b)Fig.5 MS spectrum of tetrahydropalmatine (a) and possible fragmentation pathways of tetrahydroprotoberberine-type alkaloids (b)

m/z370.129[M+H]+和m/z384.143 1[M+H]+的質(zhì)譜裂解信息與比枯枯靈相同，參考文獻(xiàn)[19-20]，推測(cè)其分別為蘇元胡堿甲和(-)-7′-O-甲基夏無(wú)堿。比枯枯靈的質(zhì)譜圖和苯酞異喹啉類生物堿可能的裂解途徑示于圖6。

2.2 未知化合物簇的鑒定

2.2.1阿樸啡類生物堿 阿樸啡類生物堿與其他生物堿在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，如果結(jié)構(gòu)中存在氮甲基，由于酰胺基中存在1個(gè)弱鍵，此類生物堿容易中性丟失(CH3)2NH或CH3NH2取代基，從而產(chǎn)生[M+H-45]+或[M+H-31]+特征片段。阿樸啡類生物堿只有側(cè)鏈的斷裂與重組，不會(huì)形成m/z較低、豐度較大的碎片離子[21]。通過(guò)與分子網(wǎng)絡(luò)中未知粒子簇的比對(duì)，鎖定F簇為此類生物堿，共鑒定出5個(gè)阿樸啡類生物堿。以化合物12和14為例，闡述此類生物堿的鑒定過(guò)程?；衔?4的準(zhǔn)分子離子峰為m/z326.138 4，m/z295[M+H-31]+為中性丟失CH3NH2，之后失去CH3OH形成m/z263碎片，說(shuō)明其存在相鄰的羥基和甲氧基，m/z235離子是m/z263丟失1個(gè)CO分子形成的，參考文獻(xiàn)[22]，推測(cè)化合物14為球紫堇堿?；衔?2的準(zhǔn)分子離子為m/z342.169 5，二級(jí)質(zhì)譜圖中未發(fā)現(xiàn)中性丟失(CH3)2NH形成的m/z297[M+H-45]+碎片峰，m/z282、265、237離子可能是m/z297離子連續(xù)失去甲基、羥基自由基和1分子CO形成的，參考文獻(xiàn)[21]，推測(cè)化合物12為木蘭花堿，其可能的裂解途徑示于圖7。

2.2.2芐基異喹啉類生物堿 芐基異喹啉類生物堿與阿樸啡類生物堿的裂解途徑相似，容易中性丟失CH3NH2取代基，然后連續(xù)丟失一些小分子或者發(fā)生α裂解。不同的是，芐基異喹啉類生物堿沒(méi)有大π共軛系統(tǒng)，會(huì)發(fā)生母核骨架斷裂，根據(jù)芐基所連接基團(tuán)的不同，形成m/z107、137、151特征碎片，母核上的氮原子沒(méi)有丟失，形成1個(gè)偶數(shù)的碎片峰[23]。據(jù)此推斷G粒子簇為芐基異喹啉類生物堿，通過(guò)提取二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定出8個(gè)化合物，其中有3個(gè)已知化合物，分別為化合物10、15和18。化合物10的準(zhǔn)分子離子峰為m/z344.194 8，產(chǎn)生m/z151特征碎片，說(shuō)明R1和R2為相鄰的甲氧基；化合物15的準(zhǔn)分子離子峰為m/z330.170 1，產(chǎn)生m/z137特征碎片，說(shuō)明R1和R2為相鄰的甲氧基和羥基；化合物18的準(zhǔn)分子離子峰為m/z314.175 0，產(chǎn)生m/z107特征碎片，說(shuō)明R1和R2為相鄰的氫和羥基。這3個(gè)化合物均未觀察到準(zhǔn)分子離子丟失CH3NH2后形成的離子，但隨后連續(xù)丟失一些小分子或者發(fā)生α裂解產(chǎn)生的碎片為取代基分配提供了支撐，參考文獻(xiàn)[17-18,24]，推測(cè)化合物10，15和18分別為可旦民堿、網(wǎng)絡(luò)番荔枝堿和亞美罌粟堿。芐基異喹啉類生物堿可能的裂解途徑示于圖8。

圖6 比枯枯靈質(zhì)譜圖(a)和苯酞異喹啉類生物堿可能的裂解途徑(b)Fig.6 MS spectrum of bicuculline (a) and possible fragmentation pathways of phthalide-type alkaloids (b)

圖7 阿樸啡類生物堿可能的裂解途徑Fig.7 Possible fragmentation pathways of aporphine alkaloids

圖8 芐基異喹啉生物堿可能的裂解途徑Fig.8 Possible fragmentation pathways of benzylisoquinoline alkaloids

2.2.3簡(jiǎn)單異喹啉類生物堿 分子網(wǎng)絡(luò)中，粒子簇E中不存在高于m/z200的正離子，由此判斷此粒子簇為簡(jiǎn)單異喹啉類生物堿，共鑒定出3個(gè)化合物?；衔?的準(zhǔn)分子離子為m/z192.101 7，連續(xù)失去1分子CH4和2分子CO，形成m/z176、148、120碎片離子，參考文獻(xiàn)[17]，推測(cè)該化合物為氫乙種北美黃連堿?；衔?和3的分子式為C11H11NO2，含有相同的碎片信息，保留時(shí)間差異大，互為位置異構(gòu)體，均從母核上連續(xù)丟失-CH3、-CO和-OCH2，形成m/z175、147、117的碎片離子，參考文獻(xiàn)[25]，推測(cè)化合物2和3分別為2,4-二甲氧基喹啉或6,7-二甲氧基喹啉。

HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)可以提高化合物篩查和鑒定的效率。目前GNPS數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的天然產(chǎn)物大多數(shù)來(lái)自于微生物和海洋生物，為發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物提供了很好的分析平臺(tái)，但中藥化學(xué)成分的收錄相對(duì)較少，在一定程度上阻礙了分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在中藥研究方面的應(yīng)用。以芐基異喹啉類生物堿和阿樸啡類生物堿為例，在GNPS中沒(méi)有匹配任何化合物，根據(jù)粒子簇中相關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)的質(zhì)譜信息，結(jié)合各類化合物的特征碎片及色譜保留行為，推斷其可能的結(jié)構(gòu)類型，再根據(jù)Scifinder、Chemspider等在線數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索的可能結(jié)構(gòu)信息鑒定未知化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了基于 HPLC-Q-TOF-MS/MS的分子網(wǎng)絡(luò)方法快速分析夏天無(wú)中生物堿，結(jié)合對(duì)照品、化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、特征離子、中性丟失和參考文獻(xiàn)等，共鑒定了夏天無(wú)中52個(gè)異喹啉類生物堿成分，包括31個(gè)已知化合物結(jié)構(gòu)和21個(gè)已知結(jié)構(gòu)類型的未知物，并總結(jié)了夏天無(wú)中生物堿的裂解規(guī)律。該方法具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品等特點(diǎn)，可對(duì)多種類型化合物進(jìn)行定性鑒別，為夏天無(wú)生物堿的進(jìn)一步提取分離和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了科學(xué)依據(jù)，為中藥中天然產(chǎn)物的鑒定提供了方法參考。