李曼倩，張曉娟，胡雪雨，王彥志,2，李建朋，郭 燕，馮衛(wèi)生,2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

干姜(ZingiberisRhizoma)為姜科姜屬植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖[1]，其主要辣味成分為姜辣素。姜辣素是含有3-甲氧基-4-羥基苯基官能團(tuán)的酚類化合物的統(tǒng)稱，根據(jù)官能團(tuán)所連脂肪鏈的不同，可分為姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜醇類等[2]。姜辣素類化合物具有鎮(zhèn)痛消炎、抗氧化、抗癌、改善心血管功能、抗炎解熱、降血糖、抑制血小板聚集等功效[3-10]。目前，已有關(guān)于特定姜辣素類化合物裂解規(guī)律的報(bào)道[11-13]，但未見(jiàn)對(duì)各類型姜辣素類化合物裂解規(guī)律的探討。

本研究擬采用具有高分辨率和高準(zhǔn)確性的電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS/MS)技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下，對(duì)6個(gè)類型共13個(gè)姜辣素類化合物的電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)理進(jìn)行解析，希望為其他天然藥物中同類姜辣素的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Triple TOF 6600型電噴霧飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司產(chǎn)品；BSA224S型電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；5424R型低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲氧基-6-姜酚、乙酰氧基-6-姜酚、乙酰氧基-8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜烯酚、(E)-4-異姜烯酚、(E)-6-異姜烯酚、(Z)-6-氧代-8-姜烯酚、姜酮、(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-6-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-8-二烯姜酮酚、6-姜二醇：由本實(shí)驗(yàn)室從干姜中分離得到，經(jīng)HPLC分析，純度>95%。13個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的6類姜辣素類結(jié)構(gòu)示于圖1，各化合物的結(jié)構(gòu)列于表1，其中(E)-4-異姜烯酚、(Z)-6-氧代-8-姜烯酚、(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-6-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-8-二烯姜酮酚為本實(shí)驗(yàn)室首次從干姜中分離得到的化合物[14]。甲醇：色譜純，美國(guó) Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

注：Ⅰ.姜酚類；Ⅱ.姜烯酚類；Ⅲ.異姜烯酚類；Ⅳ.姜酮；Ⅴ.二烯姜酮酚；Ⅵ.姜二醇圖1 6類姜辣素結(jié)構(gòu)骨架類型Fig.1 Skeleton structures of 6 gingerol

表1 13個(gè)姜辣素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical structures of 13 gingerol compounds

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

ESI電離源，正負(fù)離子模式掃描；噴霧氣壓強(qiáng)3.1×105Pa；輔助加熱氣壓強(qiáng)3.5×105Pa；氣簾氣壓強(qiáng)2.4×105Pa；去簇電壓80 V(ESI+)，-80 V(ESI-)；源溫度500 ℃；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000；注射泵進(jìn)樣速度10 μL/min；根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)選擇合適的碰撞電壓。

1.4 樣品處理

精密稱取1 mg各標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜。實(shí)驗(yàn)前，分別使用對(duì)應(yīng)的校正液對(duì)正、負(fù)離子模式進(jìn)行校正，文中給出的每個(gè)離子都是校正值。使用進(jìn)樣針?lè)謩e吸取約200 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，首先在正離子模式下進(jìn)樣分析，完成后切換至負(fù)離子模式進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

正、負(fù)離子模式下，各成分的母離子及碎片離子的數(shù)據(jù)信息分別列于表2和表3。

2.1 姜酚類化合物的裂解規(guī)律

在正離子模式下，甲氧基-6-姜酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z309，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z309分別丟失1分子H2O和CH4O生成m/z291和m/z277碎片離子，m/z277丟失C7H14形成m/z179碎片離子，m/z179進(jìn)一步丟失C2H2O(42 u)生成m/z137碎片離子。m/z291失去CH4O(32 u)生成m/z259碎片離子，m/z115是m/z291的C1—C2鍵和C6—C7鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子，m/z259的C3—C4鍵和C9—C10鍵斷裂生成m/z83碎片離子，m/z83再失去C2H4(28 u)生成m/z55碎片離子，其可能的裂解途徑示于圖2。乙酰氧基-6-姜酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z337，推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z337分別丟失1分子H2O和C2H4O2(60 u)生成m/z319和m/z277碎片離子，m/z319失去C2H4O2(60 u)生成m/z259碎片離子，m/z277丟失C9H16O(140 u)形成m/z137碎片離子。對(duì)乙酰氧基-8-姜酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行解析，推測(cè)其裂解途徑與乙酰氧基-6-姜酚的一致，二者的裂解途徑與甲氧基-6-姜酚的相似。

在負(fù)離子模式下，乙酰氧基-6-姜酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z335，推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z335分別丟失1分子CH3和C2H4O2(60 u)生成m/z320、275碎片離子，m/z275再丟失C6H10(82 u)生成m/z193碎片離子，母離子m/z335丟失C8H8O2(136 u)形成m/z199碎片離子，m/z199再丟失C2H4O2(60 u)生成m/z139碎片離子，m/z199失去C4H4O3(100 u)形成m/z99碎片離子，m/z99進(jìn)一步丟失C3H6(42 u)生成m/z57。m/z320再失去C2H3生成m/z293碎片離子，m/z293丟失C8H14O3(158 u)生成m/z135碎片離子，m/z135進(jìn)一步失去1分子CH2生成m/z121碎片離子，其二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑示于圖3。對(duì)乙酰氧基-8-姜酚、甲氧基-6-姜酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行解析，推測(cè)其裂解途徑與乙酰氧基-6-姜酚的相似，示于圖3。

表2 正離子模式下，各成分的母離子及主要碎片離子Table 2 Parent ions and major fragment ions of compounds at positive ion mode

表3 負(fù)離子模式下，各成分的母離子及主要碎片離子Table 3 Parent ions and major fragment ions of compounds at negative ion mode

圖2 正離子模式下，甲氧基-6-姜酚的二級(jí)質(zhì)譜圖(a)和可能的裂解途徑(b)Fig.2 ESI-MS/MS spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of methoxy-6-gingerol at positive ion mode

圖3 負(fù)離子模式下，乙酰氧基-6-姜酚的二級(jí)質(zhì)譜圖(a)和乙酰氧基-6-姜酚、乙酰氧基-8-姜酚可能的裂解途徑(b)Fig.3 ESI-MS/MS spectrum of acetoxy-6-gingerol (a) and proposed fragmentation pathways of acetoxy-6-gingerol and acetoxy-8-gingerol (b) at negative ion mode

圖5 正離子模式下，(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-6-二烯姜酮酚、 (4E, 6E)-8-二烯姜酮酚可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of (4E, 6Z)-4-paradoldiene, (4E, 6E)-6-paradoldiene and (4E, 6E)-8-paradoldiene at positive ion mode

2.2 姜烯酚類化合物的裂解規(guī)律

在正離子模式下，6-姜烯酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z277，推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z277發(fā)生C1—C2鍵斷裂失去C9H16O(140 u)生成m/z137特征碎片離子。10-姜烯酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z333，二級(jí)碎片離子只有m/z137，推測(cè)其裂解途徑與6-姜烯酚的一致。(E)-6-異姜烯酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z277，推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z277分別丟失1分子H2O和C6H12O(100 u)生成m/z259和m/z177碎片離子，m/z259進(jìn)一步丟失C6H8O(96 u)生成m/z163碎片離子，m/z177失去C3H4(40 u)形成m/z137碎片離子。對(duì)(E)-4-異姜烯酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行解析，推測(cè)其裂解途徑與(E)-6-異姜烯酚的一致。

(Z)-6-氧代-8-姜烯酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z319，其二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑示于圖4。推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z319分別丟失1分子H2O和C9H14O2(154 u)生成m/z301和m/z165碎片離子，m/z301進(jìn)一步丟失C2H2O(42 u)生成m/z259碎片離子，m/z259繼續(xù)丟失C5H8(68 u)生成m/z191碎片離子，m/z259也可失去C5H10(70 u)生成m/z189碎片離子，m/z189再丟失C2H2(26 u)生成m/z163碎片離子。m/z165丟失1分子CH2形成m/z151碎片離子，再失去1分子CH2生成m/z137碎片離子。

在負(fù)離子模式下，6-姜烯酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z275，推測(cè)一種裂解途徑為苯環(huán)上的O—CH3鍵斷裂，母離子m/z275丟失1分子CH3生成m/z260碎片離子，m/z260再失去C8H13O(125 u)生成m/z135碎片離子，m/z135進(jìn)一步失去1分子CH2生成m/z121碎片離子；另一種裂解途徑為C1—C2鍵斷裂，母離子m/z275失去C8H8O2(136 u)生成m/z139碎片離子。分別對(duì)10-姜烯酚、(E)-4-異姜烯酚、(E)-6-異姜烯酚、(Z)-6-氧代-8-姜烯酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行全面解析，推測(cè)其裂解途徑均與6-姜烯酚的一致。

2.3 姜酮類化合物的裂解規(guī)律

在正離子模式下，姜酮的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z195，推測(cè)其裂解途徑為C1—C2鍵斷裂，母離子m/z195失去C3H6O(58 u)生成m/z137特征碎片離子。(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z275，推測(cè)其裂解途徑為母離子m/z275分別丟失1分子H2O和C7H12(96 u)生成m/z257和m/z179碎片離子，m/z179進(jìn)一步丟失C2H2O(42 u)生成m/z137碎片離子。對(duì)(4E, 6E)-6-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-8-二烯姜酮酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行解析，推測(cè)二者的裂解途徑與(4E, 6Z)-4-二烯姜酮的一致，示于圖5。

在負(fù)離子模式下，姜酮的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z193，推測(cè)有兩種裂解途徑：1) 苯環(huán)上的O—CH3鍵斷裂，母離子m/z193丟失1分子CH3生成m/z178碎片離子，m/z178再失去C3H5O(57 u)生成m/z121碎片離子；2) C1—C2鍵斷裂，母離子m/z193失去C8H8O2(136 u)生成m/z57碎片離子。(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z273，推測(cè)有兩種裂解途徑：1)苯環(huán)上的O—CH3鍵斷裂，母離子m/z273丟失1分子CH3生成m/z258碎片離子，m/z258再失去C8H11O(123 u)生成m/z135碎片離子，m/z135進(jìn)一步失去1分子CH2生成m/z121碎片離子；2) C1—C2鍵斷裂，母離子m/z273失去C8H8O2(136 u)生成m/z137碎片離子。對(duì)(4E, 6E)-6-二烯姜酮酚、(4E, 6E)-8-二烯姜酮酚的二級(jí)碎片離子進(jìn)行解析，推測(cè)兩者的裂解途徑與(4E, 6Z)-4-二烯姜酮酚的一致。

2.4 姜醇類化合物的裂解規(guī)律

在正離子模式下，6-姜二醇的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z297，推測(cè)有兩種裂解途徑：1) 苯環(huán)上的羥基和C5上的羥基丟失，生成m/z261碎片離子，m/z261再失去C7H14(98 u)生成m/z163碎片離子；2)C4—C5鍵斷裂，且C5上的羥基丟失，生成m/z177碎片離子，m/z177再失去C3H4(40 u)生成m/z137碎片離子。

在負(fù)離子模式下，6-姜二醇的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z295，推測(cè)有兩種裂解途徑：1)苯環(huán)上的O—CH3鍵斷裂，母離子m/z295丟失1分子CH3生成m/z280碎片離子，m/z280再失去C7H15O(115 u)生成m/z165碎片離子，m/z165再丟失CH2O生成m/z135碎片離子，m/z135進(jìn)一步失去1分子CH2生成m/z121碎片離子；2)C1—C2鍵斷裂，母離子m/z295失去C8H8O2(136 u)生成m/z159碎片離子。

3 結(jié)論

采用電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法研究干姜中13個(gè)姜辣素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)各類型姜辣素類化合物的裂解途徑相似，正離子模式下均有兩種可能的裂解途徑：1) 苯環(huán)上的羥基丟失，然后側(cè)鏈發(fā)生裂解；2) 側(cè)鏈直接發(fā)生裂解，產(chǎn)生m/z179、163、137特征碎片離子。在負(fù)離子模式下，同樣有兩種可能的裂解途徑：1) 苯環(huán)取代甲氧基的O—CH3鍵斷裂，丟失1分子CH3，然后側(cè)鏈發(fā)生裂解；2) 側(cè)鏈上C1—C2鍵斷裂，產(chǎn)生主要特征碎片離子。本研究總結(jié)了姜辣素類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，有助于對(duì)干姜中其他姜辣素類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析和推斷，也可為快速分析和鑒定含有姜辣素類成分的中藥提供依據(jù)。