吳學(xué)峰，謝 斌，黃曉蘭，吳惠勤，霍延平，周 熙

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)， 廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

廣佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle的干燥果實，其味辛、苦、酸、性溫；歸肝、脾、肺經(jīng)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰等功效，用于肝胃氣滯所致的胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽多痰等癥狀[1]。廣佛手作為我國傳統(tǒng)名貴南藥，主產(chǎn)于廣東高要、德慶等地，于2016年被收錄為《廣東省嶺南中藥材保護條例》第一批受保護的8種嶺南中藥材之一，其特色不僅體現(xiàn)在產(chǎn)地方面，更體現(xiàn)在飲片炮制加工。在嶺南地區(qū)，尤其是在廣東地區(qū)的臨床上，實際應(yīng)用的佛手多為蒸制廣佛手[2]。作為嶺南特色中藥飲片，其與生品功效相似，炮制后辛燥性更低[3]。目前，佛手的化學(xué)成分組成[4-6]、藥理作用[7-9]、含量測定[10-12]及指紋圖譜[13-15]等研究主要集中在佛手生品上，而對制佛手的研究較少。汪金玉等[2,16]利用GC-MS技術(shù)研究廣佛手蒸制前后揮發(fā)性成分的差異，并建立了同時適用生、制佛手的HPLC指紋圖譜；羅朵生等[17]對生、制佛手揮發(fā)油成分含量進行分析，發(fā)現(xiàn)佛手炮制后揮發(fā)油中不飽和化合物減少、飽和化合物增多；李勇等[18-19]研究了不同炮制方法對佛手多糖與黃酮含量的影響，發(fā)現(xiàn)以水為溶劑時總多糖提取率高，炮制前后總多糖含量無明顯變化；黎珊等[20]發(fā)現(xiàn)蒸制時間對主要成分及抗氧化活性有顯著影響，蒸制2.5 h的佛手抗氧化能力最強。以上研究報道均沒有揭示蒸制廣佛手的化學(xué)成分。中藥經(jīng)炮制后化學(xué)成分往往會發(fā)生變化，繼而表現(xiàn)出不同的性味和藥效[21]。分析鑒定蒸制廣佛手化學(xué)成分，對揭示其炮制內(nèi)涵和質(zhì)量控制有重要意義。

本工作擬建立超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF MS)鑒定蒸制廣佛手的化學(xué)成分，為揭示佛手嶺南特色炮制方法的科學(xué)性、制定蒸制廣佛手質(zhì)量控制指標、研究蒸制廣佛手藥理作用等提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

1290液相色譜-G6540系列四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有ESI電噴霧離子源，紫外檢測器，MassHunter數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；TP-114型電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ2200型超聲波清洗器：東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司產(chǎn)品；H1850R離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

蒸制廣佛手藥材(批號YPA8A001)：購自廣東杏園春藥店，按照1984年版《廣東省中藥炮制規(guī)范》除去雜質(zhì)或噴水后蒸2～3 h，取出、曬干，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院潘超美教授鑒定為蕓香科植物佛手CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle的干燥果實制品。

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；蒸餾水：中國香港屈臣氏公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；乙酸銨：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

5，7-二甲基香豆素、佛手苷內(nèi)酯、香葉木苷、香葉木素、諾米林、黃柏酮、6,7-二甲氧基香豆素、棕櫚酸、原兒茶酸、圣草次苷、佛手酚，對照品：成都瑞芬思生物科技有限公司產(chǎn)品；水合羥基前胡素：上海詩丹德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；阿魏酸、檸檬苦素、橙皮苷、蘆丁、歐前胡素：廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；壬二酸：成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蔗糖：廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；蘋果酸：常州新華活性研究所產(chǎn)品；所有對照品純度均大于98%。

1.3 實驗方法

1.3.1供試品溶液制備 將蒸制廣佛手藥材粉碎后過3號篩(50目，孔徑0.355 mm)，稱取約1.0 g樣品于50 mL錐形瓶中，加入10 mL無水甲醇，搖勻，超聲1 h，靜置10 min后取上層清液，移入離心管，以14 000 r/min離心10 min，取上清液，即為供試品溶液。

1.3.2對照品溶液制備 分別精密稱取適量的各對照品于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(蔗糖加少量水溶解后，用甲醇稀釋)并定容至10 mL容量瓶中，制成單一對照品儲備液。臨用前取適量的各對照品儲備液并混合，用甲醇稀釋至各對照品濃度約為1 mg/L，即為混合對照品溶液。

1.3.3色譜條件 Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min(95%A)，2～18 min(95%～80%A)，18～30 min(80%～65%A)，30～40 min(65%～55%A)，40～50 min(55%～20%A)，50～54 min(20%～2%A)，54～56 min(2%A)，56～56.1 min(2%～95%A)，56.1～60 min(95%A)；流速0.35 mL/min；正離子模式進樣量4 μL，負離子模式進樣量6 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測器：雙波長模式；信號A、B的波長分別為254、280 nm，檢測時間60 min。

1.3.4質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)在正、負離子模式下采集數(shù)據(jù)，毛細管電壓分別為4 000、3 500 V；噴嘴電壓1 000 V；毛細管出口電壓150 V；錐孔電壓65 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速8 L/min；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；碰撞能量梯度10、20、40 eV，一級質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻[4-5]對佛手提取的研究，本實驗分別考察了70%、80%、90%、100%甲醇與乙醇作為提取液的效果。上機測定后，經(jīng)MassHunter Qualitative Analysis B.07.00軟件處理分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，甲醇提取液樣品較乙醇的成分豐富，色譜峰響應(yīng)更強、峰形更好，且100%甲醇提取液中的化學(xué)成分數(shù)量較其他比例甲醇提取液多。綜合以上，選擇100%甲醇為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

實驗對比了Poroshell 120 PFP(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)(A)、Poroshell 120 SB-C18(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)(B)、Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)(C)3種不同型號的色譜柱，以出峰個數(shù)、峰形、峰面積、分離度和基線等指標綜合評價。結(jié)果表明，采用C柱得到的色譜圖基線平穩(wěn)、峰形較好；A柱得到的譜圖基線不平穩(wěn)；相同條件下B柱對黃酮的分離度較其他色譜柱差。實驗還比較了0.1%甲酸水-甲醇溶液(A)、0.1%甲酸水-乙腈溶液(B)、0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈溶液(C)3種流動相體系。結(jié)果表明，流動相C體系下，黃酮、香豆素、有機酸等物質(zhì)均有較好的響應(yīng)，色譜峰峰形良好。綜上，最佳色譜柱為Poroshell 120 EC-C18柱，流動相為0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水-乙腈溶液。

2.3 數(shù)據(jù)處理方法

本實驗整理了文獻[4-5,22-29]中蕓香科柑橘屬植物的成分，按照名稱、化學(xué)式、CAS號、特征碎片離子等信息，建立了蕓香科柑橘屬類植物的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫(命名為：ZGFS-DATA)。

利用MassHunter Qualitative Analysis B.07.00軟件處理蒸制廣佛手提取液總離子流圖中檢測出的各色譜峰。在一級質(zhì)譜圖中，根據(jù)各色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比和誤差范圍(≤5×10-6)確定分子式。在二級質(zhì)譜圖中，獲得特定保留時間范圍的指定分子離子的二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合各數(shù)據(jù)庫推測每個峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。具體方法如下：將實驗采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Qualitative Analysis B.07.00數(shù)據(jù)分析軟件，通過菜單選項中的“方法編輯器”，在子菜單“正離子”、“負離子”中分別勾選“+H、+Na、+NH4”與“-H、+HCOO、+CH3COO”；在“數(shù)據(jù)庫/譜庫”中導(dǎo)入自建數(shù)據(jù)庫“ZGFS-DATA”，運行“按分子式查找化合物”即可完成按精確質(zhì)量數(shù)篩選出的化合物分子式，再結(jié)合二級質(zhì)譜圖的碎片離子信息推測化學(xué)結(jié)構(gòu)、對照品驗證，綜合Scifinder數(shù)據(jù)庫(https:∥scifinder.cas.org)、MassBank數(shù)據(jù)庫(http:∥www.massbank.jp)及安捷倫中藥化合物數(shù)據(jù)庫進行化學(xué)成分的分析鑒定。

2.4 鑒定結(jié)果

對蒸制廣佛手藥材成分進行分析，其總離子流圖示于圖1?？梢姡谡x子模式下，主要檢測到香豆素類、生物堿類成分，以[M+H]+多見；在負離子模式下，峰信息較豐富，黃酮及黃酮苷類、有機酸、酯類成分為主要的檢測類別，檢測離子以[M-H]-、[M+COOH]-為主；在總離子流圖的前端，主要為極性較大的糖苷類和有機酸類物質(zhì)。

利用Qualitative Analysis B.07.00分析軟件匹配分子式，利用各數(shù)據(jù)庫、文獻報道以及對照品進一步驗證，排除假陽性結(jié)果。共鑒定出67個化學(xué)成分，包括22個香豆素、12個黃酮及黃酮苷類、15個有機酸、6個糖苷類、5個檸檬苦素以及7個其他成分，其中有24個化學(xué)成分為首次在佛手中檢出，分別為奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、原兒茶酸、蔗糖、兒茶酚、七葉內(nèi)酯、木犀草素-6，8-葡萄糖苷、4-羥基苯甲醛、圣草次苷、金圣草素-6，8-葡萄糖苷、香葉木素-6-葡萄糖苷、對羥基肉桂酸、莨菪亭及其異構(gòu)體、壬二酸、異嗪皮啶及其異構(gòu)體、去乙酰鬧米林酸、鬧米林酸、獨活素、蓖麻酸、(E,E)-9-酮-10,12-十八碳二烯酸，詳細情況列于附表1(請登錄《質(zhì)譜學(xué)報》官網(wǎng)http：∥www.jcmss.com.cn下載)。其中香豆素類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎等活性[30]；有機酸類化合物，如原兒茶酸可用于消炎抗菌[31]，蘋果酸有抗氧化能力[32]；黃酮及黃酮苷類有很好的抗氧化、抗菌及抗腫瘤活性[33]；脫乙酰諾米林酸、鬧米林酸等檸檬苦素類成分具有抗癌和抗病毒作用[34]。

圖1 正(a)、負(b)離子模式下，蒸制廣佛手的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of processed citrus medica L. var. sarcodactylis swingle at positive (a) and negative (b) ion modes

2.5 蒸制廣佛手中各類成分的鑒定

2.5.1黃酮類成分鑒定 從蒸制廣佛手中共鑒定出12個黃酮類化學(xué)成分，其中橙皮苷、香葉木苷、圣草次苷、香葉木素、蘆丁通過與對照品比對得以確證。黃酮包括黃酮苷元類化合物和黃酮苷類化合物。黃酮苷元類化合物的質(zhì)譜裂解特征主要為丟失CO、COO、CH3基團，或丟失H2O等中性分子及發(fā)生逆-狄爾斯-阿德爾反應(yīng)(RDA)裂解形成一系列特征離子峰；黃酮苷類化合物主要通過連續(xù)丟失糖基形成豐度較高的黃酮苷元[5]。如成分20，保留時間為19.646 min，正離子模式下準分子離子為m/z597.179 6[M+H]+，分子式C17H32O15，在二級質(zhì)譜中有2種可能的裂解方式：1) 先丟失C6H10O4形成m/z451.112 5[M+H-C6H10O4]+碎片離子，再丟失C6H10O5形成m/z289.070 3[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+碎片離子；2) 先丟失C6H10O5形成m/z435.128 1[M+H-C6H10O5]+碎片離子，再連續(xù)丟失2個H2O分子形成m/z417.117 5[M+H-C6H10O5-H2O]+、m/z399.106 3[M+H-C6H10O5-2H2O]+碎片離子。根據(jù)化學(xué)成分的二級質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)Scifinder、MassBank及Agilent PCDL等數(shù)據(jù)庫與相關(guān)文獻[25]的支持，推測該成分為圣草次苷。該化合物首次在佛手中檢出，屬于黃酮類，具有抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等活性[35]，其二級質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖2。

2.5.2香豆素類成分鑒定 本實驗從蒸制廣佛手中共鑒定了22個香豆素類化學(xué)成分，其中6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷內(nèi)酯、水合羥基前胡素、佛手酚、歐前胡素、葡萄內(nèi)酯等與對照品比對得到確證。香豆素類化合物有相同的母核，在二級裂解過程中，其裂解特征主要為丟失 CO、CH3等基團。以成分18為例，其保留時間為19.027 min，正離子模式下準分子離子為m/z193.049 1[M+H]+，預(yù)測分子式為C10H8O4。在二級質(zhì)譜中，可先后丟失CO、CH3形成m/z150.031 2[M+H-CH3-CO]+碎片離子，再經(jīng)重排后丟失CO形成m/z122.036 5[M+H-CH3-CO-CO]+碎片離子；或者直接丟失1分子CH3OH形成m/z161.023 1[M+H-CH3OH]+碎片離子，再連續(xù)丟失2個CO基團分別形成碎片離子m/z133.028 6[M+H-CH3OH-CO]+、m/z105.033 6[M+H-CH3OH-CO-CO]+。根據(jù)化學(xué)成分的二級質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索及文獻確認[6]，該成分為莨菪亭，為首次在佛手中檢出，屬香豆素類成分，有祛暑功效[36]，其二級質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖3。

2.5.3有機酸類成分鑒定 本實驗從蒸制廣佛手中共鑒定出15個有機酸類化學(xué)成分，其中原兒茶酸、壬二酸、蘋果酸、棕櫚酸、阿魏酸等與對照品比對得到確證。有機酸類化合物二級質(zhì)譜中主要丟失H2O、HCOOH等中性分子或COO基團。成分5的保留時間為7.576 min，在負離子模式下得到準分子離子m/z153.019 6[M-H]-，預(yù)測分子式為C7H6O4。由二級質(zhì)譜可見，其失去1分子COO基團形成m/z109.030 0[M-H-COO]-碎片離子，或者失去羧基形成m/z108.020 0[M-H-COOH]-碎片離子。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索、文獻[22]及對照品比對，推斷該成分為原兒茶酸。原兒茶酸具有抗血小板凝集、抑菌、鎮(zhèn)痛等藥理活性，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗癌及預(yù)防神經(jīng)退行性疾病等藥理作用[37]，二級質(zhì)譜圖及質(zhì)譜裂解途徑示于圖4。

圖2 圣草次苷二級質(zhì)譜圖(a)及其可能的裂解途徑(b)Fig.2 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of eriocitrin

圖3 莨菪亭二級質(zhì)譜圖(a)及其可能的質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.3 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of scopoletin

圖4 原兒茶酸二級質(zhì)譜圖(a)及其可能的質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.4 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of protocatechuic acid

2.5.4糖苷類成分鑒定 本實驗從蒸制廣佛手中共鑒定出6個糖苷類化學(xué)成分。由于糖基的存在，糖苷類物質(zhì)主要以脫去己糖或戊糖產(chǎn)生特征碎片離子為主。二級質(zhì)譜中主要有[M-H-162]-(脫己糖)、[M-H-150]-(脫戊糖)及糖環(huán)開裂產(chǎn)生的[M-H-120]-、[M-H-90]-等特征離子。以成分24為例，其保留時間為21.195 min，在負離子模式下得到準分子離子m/z397.114[M-H]-，預(yù)測分子式為C18H22O10。

二級質(zhì)譜中失去1分子C6H10O5形成m/z235.061 6[M-H-C6H10O5]-碎片離子，再失去1分子CO2形成m/z191.071 8[M-H-C6H10O5-CO2]-碎片離子，最后再失去1分子CH3形成m/z176.048 1[M-H-C6H10O5-CO2-CH3]-碎片離子。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索與文獻比對[5]，推測該化合物為6-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸，其二級質(zhì)譜及可能的質(zhì)譜裂解途徑示于圖5。

圖5 6-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸二級質(zhì)譜圖(a)及可能的質(zhì)譜裂解途徑(b)Fig.5 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of cnidioside B

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合各數(shù)據(jù)庫，分析鑒定了蒸制廣佛手中化學(xué)成分，共鑒定出67個化學(xué)成分，包括12個黃酮及黃酮苷，22個香豆素，15個有機酸，6個糖苷類，5個檸檬苦素，7個其他成分，其中有24個成分為首次在佛手中檢出，同時，研究了各類成分的質(zhì)譜裂解機理，黃酮和香豆素具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗高血壓等藥理活性[38]，這兩類物質(zhì)可能是蒸制廣佛手發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究闡明了蒸制廣佛手的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為進一步明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝安捷倫中藥化合物數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)支持。