胡海俠，高燕，宏偉

（淮南市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽淮南 232007）

阿咖酚散是由對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林組成的化學(xué)復(fù)方制劑，主要用于治療普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱，也用于緩解輕至中度疼痛如頭痛、關(guān)節(jié)痛、偏頭痛、牙痛、肌肉痛、神經(jīng)痛、痛經(jīng)。目前國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［1］中該藥含量測(cè)定采用單一波長(zhǎng)高效液相色譜法，色譜峰面積差異較大，且所用對(duì)照品咖啡因?yàn)閲?guó)家管控制劑，不易取得，標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)測(cè)定靈敏度不高，且阿司匹林易分解為水楊酸雜質(zhì)，導(dǎo)致假陽(yáng)性。

筆者參考高效液相色譜波長(zhǎng)切換法［2–4］及一測(cè)多評(píng)法在石韋及其制劑［5］、長(zhǎng)城感冒片［6］、六神丸［7］及桑菊感冒顆粒［8］等含量測(cè)定中的應(yīng)用，采用高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定阿咖酚散中3 種成分及雜質(zhì)水楊酸的含量，確定了咖啡因?qū)?duì)乙酰氨基酚的相對(duì)校正因子，可不依賴對(duì)照品對(duì)咖啡因進(jìn)行定量，并提高了分析靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–20AT 型，日本島津公司。

紫外分光光度紫計(jì)：UV–2700型，日本島津公司。

超聲波清洗器：KQ–500E 型，昆山市超聲儀器有限公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)。

甲醇、磷酸二氫鉀：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)默克密理博公司。

磷酸：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號(hào)為100018–201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

咖啡因?qū)φ掌罚嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%，批號(hào)為171215–201010，中國(guó)生物制品檢定所。

阿司匹林對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號(hào)為100113–201706，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

水楊酸對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，批號(hào)為100106–201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

阿咖酚散樣品：批號(hào)為1911001、2004001，蓋天力醫(yī)藥控股集團(tuán)華東藥業(yè)有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Venusil MP–C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（0.01 mol／L 磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)解pH 至2.6±0.1）–甲醇（體積比為7∶3），流量為1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因276 nm(0～10 min)，阿司匹林254 nm(10～18 min)，水楊酸241 nm(18～25 min)；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL；理論塔板數(shù)：大于1 000；分離度：大于2.0。

1.3 溶液配制

對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林混合對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品50 mg、咖啡因?qū)φ掌?2 mg 和阿司匹林對(duì)照品92 mg 于100 mL 容量瓶中，加入流動(dòng)相約80 mL，超聲溶解，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，混勻。制成含對(duì)乙酰氨基酚0.50 mg／mL、咖啡因0.12 mg／mL、阿司匹林0.92 mg／mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL 至8 只10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，搖勻，得到對(duì)乙酰氨基酚質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200 μg／mL，咖啡因質(zhì)量濃度分別為6、12、18、24、30、36、42、48 μg／mL，阿司匹林質(zhì)量濃度分別為46、92、138、184、230、276、322、368 μg／mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

水楊酸儲(chǔ)備液：0.18 mg／mL，取水楊酸對(duì)照品18 mg，精密稱定，加入流動(dòng)相約80 mL，超聲溶解，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻。

水楊酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取水楊酸儲(chǔ)備 液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL 至5 只100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，搖勻，得到水楊酸質(zhì)量濃度分別為0.45、0.90、1.80、3.60、7.20 μg／mL的水楊酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

陰性樣品溶液：制備不含對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林的樣品，按1.4 方法進(jìn)行樣品處理。

1.4 樣品處理

取阿咖酚散國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“裝量差異”項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚50 mg)，置于100 mL 容量瓶中，加入流動(dòng)相約80 mL，超聲溶解，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)方法中使用同一波長(zhǎng)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和雜質(zhì)水楊酸的含量，同一色譜圖中色譜峰面積差異較大。查閱文獻(xiàn)得知對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因的測(cè)定波長(zhǎng)有215、225、227、257 和275 nm 等［3，9–11］，阿司匹林和水楊酸的測(cè)定波長(zhǎng)有215、302、276 和300 nm 等［9，12–13］。紫外分光光度計(jì)的光譜掃描結(jié)果表明，對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因在276 nm 處均有最大吸收，色譜圖中與其它組分差異較大，故對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的測(cè)定波長(zhǎng)選擇276 nm；阿司匹林在276 nm 處也有最大吸收，考慮到本品中阿司匹林含量較高，選擇吸收系數(shù)相對(duì)較低的254 nm 為阿司匹林的測(cè)定波長(zhǎng)；水楊酸在241 nm 處的吸收值約為在303 nm 處的兩倍，考慮到該項(xiàng)目為限量檢查，故水楊酸的測(cè)定波長(zhǎng)選擇241 nm。

2.2 色譜柱選擇

文獻(xiàn)［3–4，9–12，14–18］表明，在用高效液相色譜法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林及相關(guān)物質(zhì)水楊酸時(shí)，采用的色譜柱均為C18柱，柱長(zhǎng)150 mm 或250 mm，內(nèi)徑多為4.6 mm，涂層厚度為5 μm。分別采用Venusil MP–C18型色譜柱和CAPCELL PAK C18型色譜柱，按1.2 儀器工作條件檢測(cè)，各成分均分離理想，色譜峰形良好，因此最終選擇Venusil MP–C18型色譜柱。

2.3 柱溫和流動(dòng)相比例選擇

使用非極性固定相色譜柱分離分析，當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相的比例增加時(shí)，各組分的保留時(shí)間均提前，且咖啡因相對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚保留時(shí)間縮短較多；柱溫分別為20 ℃和25 ℃時(shí)，相對(duì)保留時(shí)間變化不大，在30 ℃時(shí)相對(duì)保留時(shí)間均前移，如表1。根據(jù)表1 試驗(yàn)結(jié)果，選擇水相和有機(jī)相的體積比為7∶3，柱溫為30 ℃。

表1 不同柱溫和流動(dòng)相下的保留時(shí)間 min

2.4 色譜圖

水楊酸在241 nm 波長(zhǎng)處吸光度遠(yuǎn)大于在245 nm 處的吸光度，水楊酸分別在241、245 nm 測(cè)定波長(zhǎng)下的高效液相色譜圖如圖1 所示。由圖1 可知，采用241 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度有較大提高。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定阿咖酚散含量的高效液相色譜圖如圖2（a）所示，圖2（b）為多波長(zhǎng)測(cè)定法的色譜圖。由圖2 可知，多波長(zhǎng)測(cè)定法在可變波長(zhǎng)下各組分色譜峰均有理想的峰形，定量更為準(zhǔn)確。

圖1 水楊酸在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的高效液相色譜圖

圖2 阿咖酚散含量測(cè)定的高效液相色譜圖

2.5 咖啡因定量

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定阿咖酚散含量時(shí)，所使用的咖啡因?qū)φ掌窞閲?guó)家管控藥品，不易取得。而在本實(shí)驗(yàn)條件下，咖啡因與對(duì)乙酰氨基酚的保留時(shí)間接近，可以考慮以乙酰氨基酚作為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算出咖啡因的相對(duì)校正因子，先用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)對(duì)乙酰氨基酚定量，然后利用內(nèi)標(biāo)法對(duì)咖啡因間接定量。

分別測(cè)定1.3 配制的8 個(gè)濃度系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行測(cè)定6 次，測(cè)定結(jié)果列于表2。由表2 可知，咖啡因與對(duì)乙酰氨基酚的相對(duì)校正因子為0.363 3。

表2 咖啡因與對(duì)乙酰氨基酚之間的相對(duì)校正因子（n=6）

2.6 線性方程與檢出限

按1.2 色譜條件測(cè)定1.3 配制的對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取上述溶液各20 μL 注入高效液相色譜儀，分析完畢后，以色譜峰面積（Y）對(duì)各組分進(jìn)樣質(zhì)量（X）進(jìn)行線性回歸，分別得各組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)。對(duì)乙酰氨基酚線性方程為Y=4.6×105X+9 468.1，相關(guān)系數(shù)為1.000 0，線性范圍為0.491 5～3.932 1 μg；咖啡因線性方程為Y=3.2×106X–845.93，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性范圍為0.126 5～1.012 0 μg；阿司匹林線性方程為Y=3.0×105X+14 947，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性范圍為0.922 7～7.381 2 μg。另取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同法操作得水楊酸的線性方程為Y=2.4×106X–5 463.1，相關(guān)系數(shù)為0.997 5，線性范圍為0.000 882 3～0.141 2 μg。參照中國(guó)藥典分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的直觀法試驗(yàn)并計(jì)算［19］，得到水楊酸的檢出限為0.441 2 ng，定量限為0.882 3 ng。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試溶液20 μL，于配制后0、2、4、8、12 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 %

由表3 數(shù)據(jù)可知，對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水楊酸含量測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.83%、0.89%、0.97%、80.79%（n=5），表明對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林在室溫12 h 內(nèi)穩(wěn)定。因阿司匹林降解產(chǎn)物為水楊酸，故水楊酸含量測(cè)定值隨時(shí)間增長(zhǎng)而增大，而阿司匹林峰面積隨時(shí)間的增長(zhǎng)而減小。

阿司匹林在堿性環(huán)境易水解，而酸性環(huán)境能抑制其水解，故實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH 值在2.6 以下，以降低阿司匹林的水解速率。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，水楊酸色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)阿司匹林的降解速率加快。建議雜質(zhì)水楊酸應(yīng)在配制后2 h 內(nèi)進(jìn)樣，對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林含量在配制后12 h 內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，樣品溶液臨用現(xiàn)配。

2.8 精密度試驗(yàn)

按本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定同一批阿咖酚散樣品中對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、水楊酸含量，平行測(cè)定5 次，結(jié)果列于表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果 %

試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水楊酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.16%、1.35%、1.23%、20.05%，說(shuō)明本方法測(cè)定乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林所得數(shù)據(jù)精密度良好，雖然水楊酸含量較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)較大，但亦可滿足測(cè)定需要。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

按照處方比例，精密稱取相當(dāng)于處方量80%、100%和120%的對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林對(duì)照品，分別加入相應(yīng)量的混合輔料及其它組分，同法平行制備兩份樣品，其中一份加入限定量的水楊酸，按1.4 步驟操作，以本法測(cè)定，計(jì)算各組分及水楊酸的回收率，結(jié)果列于表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果 %

由表5 可知，對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、的平均回收率分別為99.9%、101.2%、98.4%，水楊酸的加標(biāo)回收率為99.0%，表明本方法測(cè)量準(zhǔn)確度較高。

2.10 比對(duì)試驗(yàn)

分別取1.4 制備的樣品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，采用多波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定阿咖酚散中對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水楊酸的含量，并將測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水楊酸本法測(cè)定值的相對(duì)誤差分別為0.32%、0.41%、0.75%和9.09%。

表6 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果 %

3 結(jié)語(yǔ)

用多波長(zhǎng)法測(cè)定阿咖酚散中3 種成分及雜質(zhì)準(zhǔn)確、靈敏，一測(cè)多評(píng)法在相似色譜及儀器條件下，可以用于阿咖酚散的定量檢測(cè)和質(zhì)量控制。