齊紅，李敏，張秋紅

（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250102）

木瓜為常用中藥，俗稱皺皮木瓜，最早載于《爾雅》，為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的干燥近成熟果實，可舒筋活絡，和胃化濕，臨床多用于治療由濕引起的各種筋病，如濕痹拘攣，轉筋攣痛，腰膝關節(jié)疼痛等，不作君藥，可作佐、使藥物［1］。光皮木瓜是皺皮木瓜常見的習用品［2］，光皮木瓜在山東、四川、河北、陜西等省的地方標準中有收載，兩者在原植物形態(tài)、藥材外觀性狀和活性成分等方面存在差異［3］，不能混用。木瓜收載于國家藥典標準始于《中國藥典》1963 年版一部，《中國藥典》2020 年版收載了27 個含有木瓜的復方制劑［4］。木瓜的主要化學成分包括齊墩果酸、熊果酸、綠原酸、蘋果酸、蘆丁、槲皮素、多糖、鞣質等［5–9］，其中齊墩果酸、熊果酸不僅具有消炎抑菌、降低轉氨酶、促進肝細胞再生、防止肝硬化等功效，而且還具有一定的抗癌活性［10–11］，且以熊果酸尤為突出，是木瓜的主要藥效成分，因此測定木瓜中齊墩果酸和熊果酸具有重要意義。

目前測定齊墩果酸、熊果酸的方法主要是采用高效液相色譜法［12–14］。此外周靜等［15］采用氣相色譜法，以氮氣為載氣，選用HP1 毛細管柱（25 m×0.32 mm，0.52 μm），柱溫為280 ℃，氫火焰檢測器對女貞子中齊墩果酸和熊果酸含量進行測定，要求柱溫較高，且易引起毛細管柱涂層流失。戴云等［16］采用分光光度法測定了齊墩果酸和熊果酸對DPPH 自由基的清除率，齊墩果酸和熊果酸分子結構中僅有一個雙鍵，紫外吸收弱，操作簡便，但準確度較低。馮海燕等［17］采用毛細管電泳法測定柿蒂中齊墩果酸和熊果酸含量，操作復雜，且重現(xiàn)性較差?！吨袊幍洹?020 年版木瓜藥材采用HPLC 法測定齊墩果酸、熊果酸的總量，該方法以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺為流動相，配制較復雜，且三乙胺會縮短色譜柱壽命。與《中國藥典》2015 年版相比，2020 年版木瓜質量標準飲片項下增加了浸出物項目，飲片中齊墩果酸、熊果酸含量測定則未作規(guī)定。不同方法制備的木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量不同［18］，此外不同產(chǎn)地、不同品種木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量也存在差異。為評價木瓜飲片質量，保證藥品質量安全、有效，筆者從四川、湖北、安徽、山東等地收集部分皺皮木瓜和光皮木瓜市售飲片，通過試驗對提取條件、色譜條件進行優(yōu)化，建立了高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地皺皮木瓜飲片中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。與《中國藥典》2020年版一部木瓜含量測定方法相比，該方法操作簡單、分離度好、準確度高，可用于木瓜飲片中齊墩果酸和熊果酸的測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC–20AT 型，LCsolution 工作站，島津企業(yè)管理（中國）有限公司公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–600GDV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬能粉碎機：FW100 型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。

齊墩果酸對照品：批號為110709–201607，質量分數(shù)為91.7%，中國食品藥品檢定研究院。

熊果酸對照品：批號為110742–201622，質量分數(shù)為94.7%，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

磷酸：分析醇，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用水為純凈水。

木瓜飲片樣品：皺皮木瓜飲片為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的果實，光皮木瓜為木瓜Chaenomeles sinensis(Thouin) Koehne 的果實，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Nouryon 公司）；流動相：甲醇–0.3%磷酸（87∶13）溶液；檢測波長：210 nm；流量：1.0 mL／min；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL。

1.3 對照品混合溶液制備

精密稱取齊墩果酸對照品8.96 mg，熊果酸對照品13.61 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標線，搖勻，配制成齊墩果酸、熊果酸的質量濃度分別為0.082 2、0.128 9 mg／mL 的對照品混合溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱取皺皮木瓜飲片細粉約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，密塞，稱量并記錄質量，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）40 min，冷卻至室溫，再次稱量并記錄質量，用甲醇補足減少的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 系統(tǒng)適應性試驗

精密吸取對照品混合溶液、供試品溶液各10 μL，按1.2 色譜條件分別進樣測定。結果表明，對照品混合溶液和供試品溶液中齊墩果酸、熊果酸分離度均大于1.5，拖尾因子為1.04，理論板數(shù)按熊果酸色譜峰計不低于5 000。系統(tǒng)適應性試驗符合要求。對照品混合溶液、供試品溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 對照品混合溶液、供試品溶液色譜圖

2.2 提取條件選擇

以編號為16 的皺皮木瓜飲片樣品為待測對象，分別選擇甲醇、乙醇、體積分數(shù)為70%的甲醇溶液3 種提取溶劑對齊墩果酸、熊果酸進行提取，考察不同提取溶劑的提取效果，結果表明，以甲醇為提取溶劑時，色譜峰面積最大，基線平穩(wěn)，故采用甲醇為提取溶劑。以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲法、回流法、索氏提取法對齊墩果酸、熊果酸進行提取，考察不同提取方法的提取效果，結果表明，3 種提取方法的色譜峰面積接近，但超聲法簡單、方便，故選用超聲法對樣品進行提取。分別考察超聲時間為20、40、60 min 時的提取效果，結果表明，超聲提取40 min 時，提取較完全，故選擇超聲時間為40 min。

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別考察乙腈–0.3%磷酸溶液、甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液3 種流動相體系，結果發(fā)現(xiàn)，以乙腈–0.3%磷酸溶液為流動相時，齊墩果酸、熊果酸分離度僅為1.3；以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液為流動相時，齊墩果酸、熊果酸分離度均大于1.5。甲醇–水–冰醋酸–三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）溶液配制較復雜，三乙胺會縮短色譜柱壽命，且柱溫需控制在16～18 ℃，而甲醇–0.3%磷酸溶液（87∶13）配制簡單，操作容易，綜合考慮，選擇甲醇–0.3%磷酸溶液為流動相。

分別選擇Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、SHIMADZU VP–ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm） 和Kromasil 100–5–C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）對齊墩果酸、熊果酸進行分離，發(fā)現(xiàn)Kromasil 100–5–C18柱分離效果較好，齊墩果酸和熊果酸的色譜峰分離度均為1.7，其余兩款色譜柱的分離度均小于1.5。故選擇Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱。

2.4 線性方程與檢出限

自動進樣器分別自動吸取1.3 中的對照品混合溶液8、10、12、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，在1.2 色譜條件下，依次進樣測定，以待測化合物的質量濃度（X）為橫坐標，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數(shù)。用甲醇逐級稀釋對照品混合溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定，以3 倍信噪比（S／N）對應的溶液濃度作為方法檢出限。齊墩果酸、熊果酸的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限見表2。

表2 齊墩果酸、熊果酸的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限

2.5 穩(wěn)定性試驗

選擇編號為16 的皺皮木瓜飲片，按1.4 方法制備供試品溶液，分別于制備完成后第0、2、4、6、12、24 h 進樣測定，結果見表3。由表3 可知，齊墩果酸、熊果酸色譜峰面積測定結果的相對標準偏差分別為0.89%、1.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗結果

2.6 精密度試驗

取編號為16 的皺皮木瓜細粉6 份，每份約1.0 g，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進樣測定，結果見表4。

表4 精密度試驗結果

由表4 可知，齊墩果酸、熊果酸色譜峰面積測定結果的相對標準偏差分別為0.95%、1.14%，表明該方法精密度較好，滿足測定要求。

2.7 加標回收試驗

取編號為16 的皺皮木瓜細粉6 份，每份約0.5 g，分別加入適量的齊墩果酸、熊果酸對照品，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進樣測定，結果見表5。由表5 可知，齊墩果酸、熊果酸加標回收率分別為96.10%～99.15%、95.50～99.07%，表明該方法準確度較高。

表5 加標回收試驗結果

2.8 實際樣品測定

分別取編號為1～18 的木瓜細粉各約1.0 g，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進樣測定，結果見表6。

表6 木瓜樣品中熊果酸、齊墩果酸質量分數(shù)測定結果 %

由表6 可知，皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸總含量為0.41%～0.87%，不同產(chǎn)地的皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸總含量存在較大差異，四川的樣品含量較高?！吨袊幍洹?020 年版一部木瓜藥材含量規(guī)定，齊墩果酸和熊果酸總量不得少于0.50%，按此限度有2 批樣品不合格。光皮木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量較低，總量僅為0.20%，其中熊果酸含量較高，因此建議皺皮木瓜飲片質量標準中有必要增加齊墩果酸、熊果酸含量測定項目。

3 結語

建立了高效液相色譜法測定皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，該方法簡便、結果準確可靠，可用于皺皮木瓜飲片的質量控制。采用所建方法對不同產(chǎn)地皺皮木瓜飲片進行測定，齊墩果酸、熊果酸含量存在較大差異，皺皮木瓜質量狀況整體較好。