劉漢成，孔照霞，隆雪萍，李保成，馬小梅，扎西宗吉，劉 晶

(1.甘肅民族師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)系，甘肅 合作 747000； 2.天祝藏族自治縣人民醫(yī)院，甘肅 天祝 733200;3.青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧 810007)

唐古特大黃(Rheumtanguticum)是蓼科多年生草本植物，因其根、莖中含有蒽醌類、鞣質(zhì)類、萘類等化合物[1-2]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，是臨床常用藥物之一。目前，唐古特大黃在青藏高原被廣泛種植，對于帶動農(nóng)牧民脫貧致富效果顯著。然而，在種植過程中，土壤質(zhì)量下降或根腐病發(fā)生均導(dǎo)致唐古特大黃品質(zhì)和產(chǎn)量降低。因此，研究不同生長年限唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)和微生物群落變化狀況，有助于了解土壤理化因子和微生物群落組成對唐古特大黃產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，進而推動中草藥栽培產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

土壤營養(yǎng)元素不僅影響藥用植物的生長發(fā)育，同時也是構(gòu)成藥物有效成分的主要因子[3-4]。不同植物從土壤中獲取營養(yǎng)元素的能力由自身因素和環(huán)境因素共同決定。從植物自身來講，細胞膜的通透性及細胞膜上通道和蛋白質(zhì)的分布數(shù)量和特性直接決定著植物吸收營養(yǎng)元素的能力，表現(xiàn)為對土壤中固有的某種或多種元素的利用效率不足，進而需要通過施肥滿足植物對營養(yǎng)的需求[5-6]；環(huán)境因素如土壤pH值、溫度、水分、營養(yǎng)元素存在的形式和微生物群落組成等，都會影響植物根系對營養(yǎng)元素的吸收利用能力[7-8]，進而影響栽培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。

土壤微生物對土壤肥力形成、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化以及植物生長和病蟲害防治均有重要作用[10]。土壤固氮菌對植物生長具有顯著的促進作用，并且可以提高植株含氮量[11-13]；丁麗婧等[14]研究了微生物菌群對紫蘇生長的影響，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬菌株對紫蘇生長有促進作用；仇有文[15]研究認為，土壤微生物總量與中藥材白術(shù)的生物學(xué)產(chǎn)量之間呈正相關(guān)關(guān)系，即土壤中微生物數(shù)量越多，白術(shù)產(chǎn)量越高。但是，連作或多年生中藥材會改變土壤理化性質(zhì)，影響微生物數(shù)量及多樣性，進而影響中草藥的產(chǎn)量和品質(zhì)[16-19]。研究認為，中藥材連續(xù)種植會降低土壤肥力，進而會引起微生物群落結(jié)構(gòu)簡單化[20-21]。付麗娜等[22]研究結(jié)果也證實，中草藥連作時，植物大量吸收了土壤中的有機質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)簡單，減弱了土壤微生物的代謝能力，從而影響中草藥的栽培質(zhì)量。另外，中藥材根系分泌物也會對土壤微生物產(chǎn)生化感作用而影響其群落結(jié)構(gòu)及功能[23-24]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，懷牛膝連作可改善土壤環(huán)境，有利于植株生長，還能提高根部微生物代謝能力和多樣性[25]?？梢?，不同種類的植物生長對土壤理化性質(zhì)和根部土壤微生物的影響具有明顯差異。目前，有關(guān)不同中藥材與根部土壤微生物群落組成之間的關(guān)系已有較多報道，但截至目前，尚無關(guān)于唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成方面的研究報道。鑒于此，研究不同生長年限唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成，探索多年生唐古特大黃對根部土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成的影響，以助力唐古特大黃的產(chǎn)量提高和品質(zhì)提升。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗土樣于2019 年11 月20 日在甘南藏族自治州合作市門浪灘百草唐古特大黃種植基地采集，以未種植唐古特大黃的農(nóng)田為對照(樣點1)，以唐古特大黃生長1 a(樣點2)、2 a(樣點3)和3 a(樣點4)為3個不同生長年限處理。用直徑4 cm的土鉆在對照樣點用梅花五點取樣法采集0～15、15～30、30～45 cm土層的土壤；在不同生長年限試驗地內(nèi)，隨機選取5株唐古特大黃，用土鉆采集根部0～15、15～30、30～45 cm土層的土壤；分別將每個樣點相同土層的土壤樣品混勻后帶回實驗室,立即進行土壤微生物分離(4 ℃保存不超過 24 h)、計數(shù)。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量用烘干法測定，pH值使用pHS型酸度計測定，有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀硫酸氧化-外加熱法測定，全氮含量使用Kjeltec8200半自動定氮儀測定，全磷含量采用堿熔-鉬銻抗比色法測定，土壤全鉀含量采用堿熔-火焰光度法測定[26]。

1.3 土壤微生物數(shù)量測定

1.3.1 真菌數(shù)量 采用馬丁氏培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計數(shù)[27]。即稱取土壤鮮樣10 g，在無菌條件下用無菌水配成不同稀釋度懸浮液，取稀釋度為10-2、10-3、10-4的土壤懸浮液各50 μL，接種于盛有滅菌馬丁氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌刮刀涂抹均勻。每個濃度3次重復(fù)，恒溫(25 ℃)培養(yǎng) 5～7 d，選取每皿菌落數(shù)為 15～150 的稀釋度統(tǒng)計菌落數(shù)，計算真菌數(shù)量。菌數(shù)(cfu/g)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土質(zhì)量。

1.3.2 放線菌數(shù)量 采用改良高氏一號培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計數(shù)。取稀釋度為 10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液各50 μL接種于盛有滅菌改良高氏一號培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，其余與真菌數(shù)量測定方法相同。恒溫(28 ℃)培養(yǎng) 7～10 d，按上述方法和公式統(tǒng)計菌落數(shù)并計算放線菌數(shù)量。

1.3.3 細菌數(shù)量 采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂抹法計數(shù)。取稀釋度為 10-7、10-8、10-9的土壤懸浮液各50 μL接種于盛有滅菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，其余與真菌數(shù)量測定方法相同。恒溫(28 ℃)培養(yǎng) 3 d 統(tǒng)計菌落數(shù)，按上述方法和公式統(tǒng)計菌落數(shù)并計算細菌數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對相同生長年限不同土層深度處理、同一土層不同生長年限處理進行單因素方差分析，并用Duncan’s法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特大黃根部土壤的理化性質(zhì)

由表1可知，從不同樣點對應(yīng)土層來看，樣點1各土層土壤含水量顯著高于其他樣點對應(yīng)土層(P<0.05)，其他樣點中各土層土壤含水量隨著唐古特大黃生長年限增加而增加；樣點2各土層土壤pH值顯著高于其他樣點(P<0.05)；樣點1的0～15、15～30 cm土層有機質(zhì)含量均顯著大于其他樣點，而樣點2的0～15 cm土層有機質(zhì)含量顯著低于其他樣點(P<0.05)，在種植唐古特大黃的樣點中，有機質(zhì)含量隨唐古特大黃生長年限增加而增加；樣點3土壤全氮含量最高，其次為樣點4，樣點2最低(P<0.05)；土壤全磷含量在樣點4最高，其次為樣點1，樣點3最低；樣點1各土層全鉀含量均最高(P<0.05)，其他樣點中全鉀含量總體隨著唐古特大黃生長年限增加而增加。

表1 唐古特大黃根部土壤中含水量、pH值、有機質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量

從每一樣點的不同土層來看，樣點1和3的30～45 cm土層含水量顯著大于另外2個土層深度(P<0.05)，而其他2個樣點各土層之間無顯著差異(P>0.05)；除樣點1的30～45 cm土層pH值顯著小于15～30 cm土層外(P<0.05)，其他各樣點各土層無顯著差異(P>0.05)；除樣點2的15～30 cm土層有機質(zhì)含量顯著大于另外2個土層以外，其余各樣點中均表現(xiàn)為第1土層顯著大于其他土層(P<0.05)；樣點1和4的0～15 cm土層全氮含量均顯著高于其他2個土層，樣點2的15～30 cm土層全氮含量最高，樣點3的30～45 cm土層全氮含量最高(P<0.05)；樣點1的0～15 cm土層全磷含量最高，在樣點2中各土層全磷含量無顯著差異，樣點3和4均表現(xiàn)為30～45 cm土層全磷含量最高；樣點1的30～45 cm土層全鉀含量最低，而0～15、15～30 cm土層全鉀含量無顯著差異，樣點2各土層全鉀含量無顯著差異，樣點3的15～30 cm土層、樣點4的30～45 cm土層全鉀含量顯著高于其他2個土層(P<0.05)。

2.2 生長年限和土層深度對唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)的影響

F測驗(表2)表明，生長年限對唐古特大黃根部土壤含水量、pH值、有機質(zhì)含量、全氮含量、全磷含量和全鉀含量影響極顯著(P<0.01)；土層深度對土壤含水量、有機質(zhì)含量、全磷含量、全鉀含量影響極顯著(P<0.01)，而對pH值和全氮含量無顯著差異；生長年限×土層深度對土壤有機質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量影響極顯著(P<0.01)，而對含水量和pH值無顯著差異。

表2 唐古特大黃根部土壤中含水量、pH值、有機質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量的方差分析

2.3 唐古特大黃根部土壤的微生物群落特征

從表3可以看出，唐古特大黃根部土壤中細菌數(shù)量最多，其次為放線菌，真菌數(shù)量最少。從三大類微生物在不同樣點各土層的分布來看，0～15 cm土層，樣點1的土壤細菌和放線菌數(shù)量顯著大于其他樣點，以樣點4細菌數(shù)量最少，真菌數(shù)量則表現(xiàn)為樣點3顯著小于其他樣點(P<0.05)，其他 3個樣點無顯著差異(P>0.05)；15～30 cm土層，細菌和放線菌數(shù)量仍然在樣點1最多，其他3個樣點間無顯著差異，4個樣點真菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)；30～45 cm土層，細菌和放線菌數(shù)量表現(xiàn)為樣點1極顯著大于其他樣點，細菌數(shù)量在樣點2最少，放線菌數(shù)量在樣點3最少，而真菌數(shù)量表現(xiàn)為樣點3和4顯著大于其他2個樣點(P<0.05)。

從微生物在各樣點的分布來看，樣點1中，細菌數(shù)量隨土層深度增加而逐漸減少，各土層間差異顯著，15～30、30～45 cm土層中放線菌數(shù)量顯著大于0～15 cm土層(P<0.05)，真菌數(shù)量在0～15、15～30 cm土層間無顯著差異，但顯著多于30～45 cm土層；樣點2中，細菌數(shù)量分布與樣點1相同，放線菌數(shù)量在3個土層間無顯著差異，0～15 cm土層真菌數(shù)量最多；樣點3中，細菌數(shù)量仍以0～15 cm土層最多，15～30、30～45 cm土層放線菌數(shù)量無顯著差異，但顯著高于0～15 cm土層，真菌數(shù)量在各土層間無顯著差異(P>0.05)；樣點4中，細菌和真菌數(shù)量在各土層間無顯著差異，而放線菌數(shù)量以30～45 cm土層最多，顯著大于0～15、15～30 cm土層(P<0.05)。

表3 唐古特大黃根部土壤微生物群落特征Tab.3 Characteristics of soil microbial community in the rhizosphere of Rheum tanguticum

2.4 生長年限和土層深度對唐古特大黃根部土壤微生物群落的影響

根據(jù)生長年限和土壤土層深度及二者共同作用對唐古特大黃根部土壤中細菌、放線菌和真菌數(shù)量的主體效應(yīng)分析(表4)可知，生長年限對細菌和放線菌數(shù)量的影響極顯著(P<0.01)，對真菌數(shù)量影響顯著(P<0.05)；不同土層深度細菌和放線菌數(shù)量差異極顯著(P<0.01)，而其對真菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)；生長年限×土層深度對細菌和放線菌數(shù)量的影響極顯著(P<0.01)，對真菌數(shù)量影響顯著(P<0.05)。

表4 唐古特大黃根部微生物數(shù)量的方差分析Tab.4 Variance analysis on the soil microorganism quantity in the rhizosphere of Rheum tanguticum

2.5 唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)與微生物群落相關(guān)性

由表5可知，唐古特大黃根部土壤含水量與土層深度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；pH值與生長年限呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與含水量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；有機質(zhì)含量與生長年限呈顯著負相關(guān)，與含水量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；全氮含量與土壤有機質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)，而與pH值呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；全磷含量與有機質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與含水量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；全鉀含量與含水量、有機質(zhì)含量、全氮含量呈極顯著正相關(guān)，與pH值呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；細菌數(shù)量與有機質(zhì)、全鉀含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與含水量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與生長年限和土層深度呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；放線菌數(shù)量與土壤含水量、有機質(zhì)含量、全鉀含量和細菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)，但與生長年限呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；真菌數(shù)量則與生長年限、全磷含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表5 唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)與微生物數(shù)量Pearson相關(guān)性分析Tab.5 Pearson correlation analysis between physical and chemical properties and microbial quantity in soil of rhizosphere of Rheum tanguticum

續(xù)表5 唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)與微生物數(shù)量Pearson相關(guān)性分析Tab.5(Continued) Pearson correlation analysis between physical and chemical properties and microbial quantity in soil of rhizosphere of Rheum tanguticum

3 結(jié)論與討論

3.1 不同生長年限和土層深度對唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)的影響

連續(xù)種植會改變土壤的理化性質(zhì)，進而影響到栽培植物的品質(zhì)和生產(chǎn)性能[20-21,28]。中草藥大多為單品種連續(xù)種植，這種種植模式下土壤的理化性質(zhì)較其他種植模式更容易改變。張向東等[29]、朱亞等[30]研究了商洛地區(qū)中藥材種植地土壤理化特性，認為土壤中磷含量較高，但有機質(zhì)、全氮和全鉀等缺乏。路京等[31]比較了不同種植模式下杭白菊土壤理化性質(zhì)，認為輪作的杭白菊根部土壤肥力和生物多樣性均高于連作，有利于杭白菊高產(chǎn)。祖勒胡瑪爾·烏斯?jié)M江[32]研究了連作和輪作對甘草種植地土壤理化性質(zhì)的影響，認為連作模式土壤養(yǎng)分顯著低于輪作模式。王娟英等[33]研究了不同連作年限懷牛膝土壤中元素含量的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)懷牛膝連作會使土壤中大部分元素含量增加，而對全氮、全鉀含量的影響不大。

從本研究結(jié)果來看，唐古特大黃根部土壤含水量隨生長年限的增加呈上升趨勢，可見，隨著唐古特大黃生長年限的增加，土壤中有機質(zhì)含量升高，土壤持水能力也加強。而土壤pH值除樣點1外，隨著唐古特大黃生長年限的增加而降低，說明唐古特大黃根系分泌物可有效降低土壤酸堿度；在種植唐古特大黃各樣點內(nèi)，隨生長年限的增加，土壤有機質(zhì)含量逐漸增加，這可能是pH值降低的原因[34]，這一現(xiàn)象在樣點2表現(xiàn)明顯，樣點2有機質(zhì)含量最低，其土壤pH值最高。除樣點1外，土壤全氮含量在唐古特大黃生長2 a的樣點3最高，樣點4次之，樣點2最低，其原因主要是樣點2土壤質(zhì)地貧瘠、營養(yǎng)元素匱乏，而樣點3和樣點4三個土層土壤全氮含量隨生長年限增加表現(xiàn)為降低，說明植物在生長過程中吸收利用了土壤中的氮。全磷含量在樣點4最高，這與朱亞等[30]、王娟英等[33]的研究結(jié)果一致，即隨生長年限增加，磷元素含量增加。全鉀含量隨唐古特大黃生長年限增加也表現(xiàn)出增加趨勢，這與前人研究結(jié)果[35-37]一致。

3.2 不同生長年限和土層深度對唐古特大黃根部微生物群落的影響

細菌、放線菌和真菌是土壤微生物的三大類群，一般而言，細菌數(shù)量最多，放線菌次之，真菌數(shù)量最少，但也有部分土壤中真菌數(shù)量多于放線菌[38]。如前所述，連作會影響土壤理化性質(zhì)，而中藥材由于多年種植其根部分泌物的增加會改變土壤理化性質(zhì)，進而引起土壤生物分布及數(shù)量的變動，尤其是對環(huán)境變化敏感的微型生物[39]。土壤微生物的變化是造成連作障礙的主要原因[40]，王茂勝等[41]分析了不同連作年限植煙土壤中微生物群落動態(tài)，發(fā)現(xiàn)隨著連作年限增加，土壤中細菌數(shù)量顯著減少，而真菌和放線菌數(shù)量顯著增加；而在懷牛膝連作10 a和30 a的土壤中，微生物總量增長，表現(xiàn)出懷牛膝連作的促進作用[33]。從本研究結(jié)果來看，唐古特大黃根部土壤中細菌數(shù)量>放線菌數(shù)量>真菌數(shù)量，與前人研究結(jié)果一致。從生長年限來看，細菌數(shù)量隨生長年限的增加而減少，而放線菌和真菌數(shù)量顯著增加，這與王茂勝等[41]的研究結(jié)果一致。從微生物的垂直分布來看，除放線菌外，細菌和真菌數(shù)量均隨土層深度的增加而減少，與前人研究結(jié)果一致[42-44]，這主要是由于表層土壤中充足的營養(yǎng)和氧氣以及適宜的溫濕度條件更有利于微生物生長繁殖[45]。本研究中放線菌的數(shù)量隨土層深度增加而增加，原因尚不明確，可能是唐古特大黃根部分泌物對該類群的影響所致。

3.3 唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)對微生物群落的影響

不同植物根部對土壤或表現(xiàn)為促進作用，或表現(xiàn)為抑制作用[46-47]。單品種作物連作會消耗土壤中的營養(yǎng)元素，減少土壤微生物的營養(yǎng)來源，致使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)簡單化，甚至降低微生物數(shù)量[20,22]。而郝慧榮等[48]認為，懷牛膝連作10 a、20 a甚至30 a以上，土壤理化性質(zhì)均有所改善，微生物群落結(jié)構(gòu)也趨于復(fù)雜。本研究中，從唐古特大黃根部土壤理化性質(zhì)和微生物群落相關(guān)性來看，土壤中細菌和放線菌數(shù)量與唐古特大黃生長年限呈極顯著負相關(guān)，而真菌數(shù)量與生長年限呈顯著正相關(guān)，說明種植唐古特大黃對土壤中細菌和放線菌有一定的抑制效應(yīng)，而對真菌生長有促進作用。當(dāng)然，微生物數(shù)量隨唐古特大黃生長年限增加而下降可能也與該種植基地的施肥策略有關(guān)，在該基地，唐古特大黃種植前施油渣為基肥，種植幼苗后不再施肥直至收獲。