谷巖，侯驪坤，劉輝，何菊

（天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192）

肢體的創(chuàng)傷、手術(shù)、血栓形成均可引起肢體缺血，而隨著血流的恢復(fù)，在缺血后恢復(fù)血流在某些情況下導(dǎo)致進(jìn)一步組織損傷和功能障礙，甚至出現(xiàn)遠(yuǎn)隔臟器的損傷[1]，也就是肢體缺血再灌注損傷（LI-RI）。危重患者可導(dǎo)致多器官功能障礙，其通常是一個(gè)致命性的結(jié)局。因此，針對(duì)LI-RI的病理機(jī)制及其防治機(jī)制的研究，對(duì)有效防治或保護(hù)急性肢體缺血損傷，降低致殘率和病死率，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。炎性因子在LI-RI過(guò)程中尤為重要，其中白介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等多種細(xì)胞因子大量釋放并導(dǎo)致了機(jī)體自身組織和器官的損傷，因此炎性因子水平是LI-RI程度的一個(gè)標(biāo)志[2-3]本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠缺血再灌注的動(dòng)物模型，觀察缺血前后及用藥前后大鼠體內(nèi)不同組別中肢體缺血再灌注損傷期炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10及其mRNA的變化規(guī)律，從而探討丹酚乙酸鎂對(duì)大鼠肢體缺血再灌注的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，級(jí)別SPF級(jí)，體質(zhì)量（240±10）g。（北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，天津放射所動(dòng)物房飼養(yǎng)）。老鼠飼養(yǎng)條件：22～25℃，12 h明暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)食物顆粒。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只大鼠。第1組為空白對(duì)照組；第2組為缺血再灌注組，接受腹腔生理鹽水（SP）治療；第3組是接受低濃度治療的缺血再灌注組（12 mg/kg）（簡(jiǎn)稱低濃度處理組）；第4組為接受高濃度治療的缺血再灌注組（24 mg/kg）（簡(jiǎn)稱高濃度處理組）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。大鼠IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。大鼠IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。大鼠TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。各種動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。

1.3 缺血再灌注模型制備及標(biāo)本采集 按照經(jīng)典方法制備大鼠缺血再灌注模型[4]。大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。戊巴比妥鈉（首劑40 mg/kg，維持劑量20 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，右下肢股三角區(qū)剪毛，于腹股溝處沿血管走行縱行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動(dòng)、靜脈和股神經(jīng)。用微血管夾分別夾閉右股動(dòng)脈。缺血2 h后，放松微血管夾恢復(fù)血流灌注2 h。假手術(shù)組治療方法相同，但未阻斷股動(dòng)脈血流。再灌注前15 min，給第2組腹腔注射生理鹽水，給第3組注射低濃度丹參多酚酸鹽，給第4組注射高濃度丹參多酚酸鹽。缺血2 h后。從每只大鼠下腔靜脈抽取約10 mL血液進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.4 血清 TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10水平的測(cè)定 將全血收集到含抗血凝劑的管中，混合20min，在4℃條件下1 000×g，離心半徑160 mm，離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24 h內(nèi)檢測(cè)可放入2～8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。將取得的上清液用ELISA法按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA水平 首先提取外周淋巴細(xì)胞，將稀釋后的血液進(jìn)行離心，洗滌，棄去上清液。按TRIzol法提取RNA，用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度和純度，直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總反應(yīng)體系 20 μL，包括樣品 RNA 2 g，DEPC 焦磷酸二乙酯水 7 μL，OligodT 1 μL，RNA 酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，5×MMLV buffer 4 μL，MMLV RT 1 μL。

反應(yīng)條件為：70℃5min，42℃60min，70℃10min根據(jù)Gene bank數(shù)據(jù)庫(kù)中參考序列設(shè)計(jì)用于Realtime PCR的引物，并采用Blast程序比對(duì)確定引物的特異性，用β-actin作為內(nèi)參。IL-1β上游引物：5’-AGGTGGTGTCGGTCATCGT-3’，下游引物：5’-GCTCTCTGTCCTGGAGTTTGC-3’；IL-6 上游引物：5’-ATGCTTCCAATCTGGGTTC-3’，下游引物：5’-TGAGGATAATCTTTGCGTTC-3’；TNF-α 上游引物：5’-ACGGGCTTTACCTCATCTACTC-3’，下游引物：5 ’-GCTCTTGATGGCAGACAGG-3’；IL-10 上游引物：5’-CAGTCAGCCAGACCCACAT-3’，下游引物：5’-GCTCCACTGCCTTGCTTT-3’；β-actin 上游引物：5’-CCAAGGCCAACCGTGAGAAGAT-3’，下游引物：5’-CCACGTTCCGTGAGGATCTTCA-3’。

Real-time PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)采用SYRB Green I染料法，使用熒光定量全自動(dòng)PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增采用兩步法，反應(yīng)條件為：94℃5 min預(yù)變性后，94℃ 10 s，58℃ 30 s，共進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)，再于72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄相應(yīng)的Ct值。以β-actin的Ct值為參照，計(jì)算Δt，運(yùn)用公式2-Δt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS 24.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組中炎性因子水平的結(jié)果及比較 與空白對(duì)照組相比，缺血再灌注組中TNF-α、IL-1B、IL-6和IL-10 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，低濃度處理組和高濃度處理組中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-10 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高濃度處理組與低濃度處理組相比，TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低，IL-10 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組炎性因子水平比較Tab.1 Comparison of inflammatory factors in each group pg/mL

2.2 各組中炎性因子mRNA表達(dá)水平的結(jié)果及比較

2.2.1 血清中TNF-αmRNA表達(dá)情況 正常情況下，空白對(duì)照組血清中有少量TNF-α表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，缺血再灌注組血清中TNF-α表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，高濃度處理組和低濃度處理組中TNF-α表達(dá)明細(xì)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高濃度處理組與低濃度處理組相比，血清中TNF-α表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1。

圖1 各組中TNF-αmRNA表達(dá)情況比較Fig.1 Comparison of TNF-α mRNA expression in each group

2.2.2 血清中IL-1βmRNA表達(dá)情況 正常情況下，空白對(duì)照組血清中有少量IL-1β表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，缺血再灌注組血清中IL-1β表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，高濃度處理組和低濃度處理組中IL-1β表達(dá)明細(xì)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高濃度處理組與低濃度處理組相比，血清中IL-1β表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 各組中IL-1βmRNA表達(dá)情況比較Fig.2 Comparison of IL-1 β mRNA expression in each group

2.2.3 血清中IL-6mRNA表達(dá)情況 正常情況下，空白對(duì)照組血清中有少量IL-6表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，缺血再灌注組血清中IL-6表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，高濃度處理組和低濃度處理組中IL-6表達(dá)明細(xì)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高濃度處理組與低濃度處理組相比，血清中IL-6表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 各組中IL-6 mRNA表達(dá)情況比較Fig.3 Comparison of IL-6 mRNA expression in each group

2.2.4 血清中IL-10 mRNA表達(dá)情況 正常情況下，空白對(duì)照組血清中有少量IL-10表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，缺血再灌注組血清中IL-10表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與缺血再灌注組相比，高濃度處理組和低濃度處理組中IL-10表達(dá)明細(xì)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高濃度處理組與低濃度處理組相比，血清中IL-10表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4。

圖4 各組中IL-10 mRNA表達(dá)情況比較Fig.4 Comparison of IL-10 mRNA expression in each group

3 討論

肢體缺血再灌注在血管外科、骨科、創(chuàng)傷等多種情況下發(fā)生。其影響的并非單純是出現(xiàn)缺血的肢體，通過(guò)一系列的炎性反應(yīng)等病理過(guò)程，造成大量炎性細(xì)胞因子和有害物質(zhì)的生成和釋放，從而對(duì)遠(yuǎn)隔的心、肺、腦、腎等重要器官功能造成損害[5]。

炎癥細(xì)胞因子在肢體缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用，在肢體發(fā)生缺血再灌注后，細(xì)胞會(huì)釋放一氧化氮、TNF-α、IL-1及IL-6等炎癥細(xì)胞因子，對(duì)受損的細(xì)胞組織產(chǎn)生二次損傷。這兩種細(xì)胞因子都具有多種致炎活性，包括白細(xì)胞趨化、吞噬細(xì)胞刺激、增強(qiáng)下游細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。TNF-α可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)IL-1、IL-6的分泌，并能促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，從而刺激擴(kuò)大機(jī)體局部炎癥反應(yīng)及組織的損傷[6]。在以往的研究實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了當(dāng)缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，炎性細(xì)胞因子會(huì)出現(xiàn)明顯升高的情況[7]，因此炎性因子在缺血再灌注過(guò)程中的表達(dá)水平可以反應(yīng)炎癥反應(yīng)的劇烈程度，同時(shí)也可以反應(yīng)出缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度，而同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注發(fā)生時(shí)，阻斷這些炎性因子的表達(dá)，可以減輕缺血再灌注損傷的程度[8]。

有研究證明，IL-10具有抗炎作用，抑制其他炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。另外有研究證明IL-10在通過(guò)抑制單核巨嗜細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)的作用，使得血漿中TNF-α和IL-1及IL-6炎性介質(zhì)水平降低[10]。而在局部炎性反應(yīng)中，IL-10可以降低T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性[11]，因此也成為影響缺血再灌注損傷的重要因素。

丹酚乙酸鎂又稱丹參乙酸鎂是丹參多酚酸鹽的主要有效成分，是一種丹參提取物。在多項(xiàng)關(guān)于抗氧化，清除自由基和缺血再灌注損傷的臨床研究中，丹參多酚酸鹽均顯示出良好的效果[12]。在心臟和腦組織的缺血再灌注研究中也發(fā)現(xiàn)具有很好的治療效果[13]。在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)大鼠下肢缺血再灌注實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的給予丹參多酚處理，觀察丹參多酚鹽對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響，討論其對(duì)于肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立大鼠下肢缺血再灌注模型，在缺血再灌注2 h后取血，在實(shí)驗(yàn)組中給予不同劑量的丹參多酚酸鹽處理。通過(guò)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 和 IL-10 的數(shù)值進(jìn)行各組比較。缺血再灌注組中TNF-α、IL-6、IL-1β指標(biāo)的數(shù)值較假手術(shù)組明顯升高，說(shuō)明缺血再灌注過(guò)程中，炎性細(xì)胞因子的升高，從而發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)出現(xiàn)組織損傷，這與之前的其他研究報(bào)導(dǎo)結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)經(jīng)丹參多酚酸鹽處理組的血中炎性指標(biāo)的測(cè)定，與缺血再灌注組相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是高濃度處理組還是低濃度處理組，其炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平明顯下降。說(shuō)明丹參多酚酸鹽處理后明顯降低了炎性細(xì)胞因子的水平，降低炎癥反應(yīng)的程度，減輕了缺血再灌注損傷的程度。此外在經(jīng)丹參多酚酸鹽處理組和缺血再灌注組的比較當(dāng)中，抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平顯著升高，表明丹參多酚可以明顯增強(qiáng)了IL-10的水平，從而起到抑制炎性細(xì)胞因子的釋放以減輕缺血再灌注損傷的程度。同時(shí)在高低濃度處理組之間的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β和IL-6水平在高濃度處理組中較低濃度處理組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-10水平是升高的，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此可以推斷丹參多酚酸鹽可以降低缺血再灌注后血清中炎性因子，提高血清中抗炎因子的水平，起到減輕缺血再灌注損傷的作用，同時(shí)這種作用是與丹參多酚酸鹽的濃度成正相關(guān)的。

同時(shí)，在本次實(shí)驗(yàn)中還同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行了 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 的 mRNA表達(dá)水平的定量測(cè)定并進(jìn)行了比較。在缺血再灌注組中各項(xiàng)指標(biāo)的mRNA水平較空白組均顯著升高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與之前的臨床報(bào)導(dǎo)一致。說(shuō)明缺血再灌注過(guò)程明顯誘發(fā)了炎性因子mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，從而引起一系列炎癥反應(yīng)，最終造成缺血再灌注損傷。通過(guò)對(duì)處理組中炎性因子表達(dá)水平的測(cè)定，與缺血再灌注組相比較，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子水平顯著降低，IL-10因子mRNA表達(dá)水平明顯升高。說(shuō)明在經(jīng)過(guò)丹參多酚酸鹽處理后，能夠明顯降低炎性因子的mRNA表達(dá)水平。

丹參類藥物對(duì)于缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究為數(shù)不少，但多集中于心、腦組織的缺血再灌注損傷[14]，對(duì)于肢體缺血再灌注損傷的研究相對(duì)不多。比較以前的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察[15-16]，也證實(shí)了丹參多酚對(duì)肢體缺血再灌注的保護(hù)作用，但以往的研究多為丙二醛和超氧化物歧化酶作為缺血再灌注損傷的參照指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)中觀察了丹參多酚對(duì)于炎性因子及其mRNA表達(dá)的調(diào)控作用，更進(jìn)一步揭示了丹參多酚對(duì)于肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

總之，在本次實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽通過(guò)上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子水平，降低血漿中炎性細(xì)胞因子的濃度，使得缺血再灌注過(guò)程中組織的損傷程度得以減輕，從而起到保護(hù)作用。