郭冰清，蔣濤

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，江蘇 常州 213000)

細胞死亡是細胞生命結(jié)束的標(biāo)志，可出現(xiàn)在胚胎發(fā)育、生物內(nèi)環(huán)境平衡等生理病理過程中。細胞死亡模式分為非程序性細胞死亡和程序性細胞死亡兩大類。非程序性細胞死亡即被動型死亡，主要包括自溶或異溶等；程序性細胞死亡即主動型死亡，包括自噬、凋亡、程序性壞死、鐵死亡、焦亡等[1-2]。研究表明，鐵死亡與許多疾病的生理病理過程密切相關(guān)，如腎損傷、腫瘤、缺血再灌注損傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及骨代謝疾病等[3-4]。鐵死亡是一種非凋亡性細胞死亡方式，與其他細胞程序性死亡(包括傳統(tǒng)的凋亡、自噬、壞死、焦亡等)有顯著區(qū)別，其主要特征為鐵依賴性活性氧類(reactive oxygen species，ROS)在細胞內(nèi)大量累積，從而促使細胞死亡[5]。鐵死亡指在Fe2+或脂氧合酶的作用下，細胞膜高表達的不飽和脂肪酸被催化，發(fā)生脂質(zhì)體過氧化，最終導(dǎo)致細胞死亡[6]。常見骨代謝疾病——骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與鐵超載以及脂質(zhì)過氧化均密切相關(guān)?，F(xiàn)就鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥的研究進展予以綜述。

1 細胞鐵死亡概述

1.1細胞鐵死亡的發(fā)現(xiàn)和命名 2003年，Dolma等[7]發(fā)現(xiàn)，erastin具有誘導(dǎo)癌細胞死亡的能力，且erastin誘導(dǎo)細胞死亡時胱天蛋白酶(caspase)3活化以及細胞核形態(tài)改變(核碎裂、染色質(zhì)凝集、細胞體積縮小)等典型特征均未出現(xiàn)，而caspase抑制劑對erastin誘導(dǎo)的細胞死亡亦無顯著抑制作用，故推測可能存在一種有別于經(jīng)典細胞凋亡模式的全新細胞死亡方式。2007年，Yagoda等[8]報道顯示，erastin通過致癌H-Ras誘導(dǎo)了腫瘤細胞快速、氧化和非凋亡性死亡。2008年，Yang和Stockwell[9]研究發(fā)現(xiàn)，Ras選擇性致死化合物與erastin具有相似性，且檢測到ROS和鐵水平升高均與Ras信號密切相關(guān)。直至2012年，Dixon等[5]證實，erastin誘導(dǎo)的細胞死亡在形態(tài)學(xué)、生化特性以及遺傳學(xué)等方面與壞死、凋亡和自噬等均不同，其特征是鐵依賴性ROS在胞內(nèi)大量堆積，并依據(jù)這一特征將其正式命名為鐵死亡。

1.2細胞鐵死亡的主要特征 作為全新非凋亡性細胞死亡模式，鐵死亡不同于其他的細胞程序性死亡(如凋亡、自噬、壞死或者焦亡)，見表1[10-11]。

表1 細胞鐵死亡、凋亡、自噬、壞死和焦亡的特征

在形態(tài)學(xué)上，細胞鐵死亡主要表現(xiàn)為細胞變小、變圓、細胞間分離；細胞膜完整并聚縮、質(zhì)膜起泡，無核固縮；線粒體皺縮、線粒體嵴減少或消失、線粒體膜密度增加以及線粒體外膜破裂等[12]。

在分子作用機制上，當(dāng)Ras選擇性致死化合物3(Ras-selective lethal compound 3，RSL3)誘導(dǎo)細胞鐵死亡時，RSL3直接靶向谷胱甘肽(glutathione，GSH)依賴性酶——谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)4；GPX4通過催化GSH依賴的高反應(yīng)性脂質(zhì)氫過氧化物還原為非反應(yīng)性脂質(zhì)醇，限制脂質(zhì)過氧化的能力，以保護細胞免受膜脂質(zhì)過氧化作用，目前GPX4已成為鐵死亡的主要內(nèi)源性抑制劑[13]。erastin通過抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體(cystine/glutamate antiporter，system Xc-)降低細胞內(nèi)半胱氨酸和GSH水平，這一機制間接影響了GPX4的催化循環(huán)，導(dǎo)致大量ROS聚集，從而誘發(fā)鐵死亡[14-15]。

從遺傳學(xué)角度分析，鐵死亡在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中均起到重要作用，在腫瘤性疾病的治療中，利用特異性鐵死亡開發(fā)的抗腫瘤藥物已應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，整個鐵死亡過程受多種基因調(diào)控，主要涉及鐵穩(wěn)態(tài)[16-19]、ROS以及脂質(zhì)過氧化過程等[20-23]。

1.3細胞鐵死亡的誘導(dǎo)劑和抑制劑

1.3.1細胞鐵死亡的誘導(dǎo)劑 參與誘導(dǎo)鐵死亡的物質(zhì)主要包括兩類：system Xc-抑制劑：system Xc-是廣泛分布于磷脂雙層中的一種氨基酸反向轉(zhuǎn)運蛋白，屬于細胞中重要的抗氧化系統(tǒng)[24]。system Xc-抑制劑通過抑制system Xc-的活性(即通過抑制胱氨酸的吸收)影響GSH的合成，導(dǎo)致GPX4活性降低，使細胞的抗氧化應(yīng)激水平減弱，脂質(zhì)ROS大量產(chǎn)生，最終引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致鐵死亡[25]。GPX4抑制劑：GPX4作為細胞鐵死亡的關(guān)鍵因子，可催化GSH轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸虶SH，使具有細胞毒性的脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇[13]。抑制GPX4活性可以間接誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的積累。erastin作為system Xc-抑制劑，可直接靶向細胞中的線粒體電壓依賴性陰離子通道蛋白，進而降低GPX4活性[7]。還有一種小分子FIN56(一種特異性鐵死亡誘導(dǎo)劑)則通過與角鯊烯合酶結(jié)合并消耗抗氧化劑輔酶Q10降解GPX4，達到抑制GPX4的目的；而FINO2(一種特異性鐵死亡誘導(dǎo)劑)可間接滅活GPX4以誘導(dǎo)鐵死亡[10,24]。

1.3.2細胞鐵死亡的抑制劑 目前抑制鐵死亡的方法主要包括：①抑制鐵的累積，如鐵螯合劑通過調(diào)平鐵穩(wěn)態(tài)，減少Fe2+蓄積，進一步抑制鐵死亡進程；②通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)達到抑制鐵死亡的目的，鐵抑素-1是第一代鐵抑素，其活性依賴于芳香胺結(jié)構(gòu)，芳香胺結(jié)構(gòu)可特異性抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的ROS的積累[10]。Zileuton是一種新型5-脂氧合酶抑制劑，可抑制胞質(zhì)中ROS的產(chǎn)生，對diagnosis和erastin誘導(dǎo)的HT22細胞鐵死亡模型具有顯著的保護作用[26]。

1.3.3中藥提取物 除了各種天然或人工合成的化合物外，中藥提取物及其衍生物也可誘導(dǎo)細胞鐵死亡的發(fā)生。例如，常見的青蒿素類化合物(青蒿素、蒿乙醚、青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素等)均為鐵死亡的誘導(dǎo)劑，現(xiàn)已證實，青蒿素類化合物對人體不同組織惡性腫瘤具有優(yōu)先的細胞毒性作用，可通過誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生進行抗腫瘤治療，且具有一定的安全性和良好的耐受性[27]。來源于天然甘草酸的異甘草酸鎂則可直接誘導(dǎo)肝星狀細胞的鐵死亡[28]。另一方面，來源于中藥黃芩的黃酮類化合物黃芩苷元可以抑制細胞鐵死亡，對創(chuàng)傷后癲癇發(fā)作具有神經(jīng)保護作用[29]。兒茶酚類黃酮槲皮素及其代謝物具有抗鐵死亡和抗氧化活性，可通過抗氧化應(yīng)激作用抑制鐵死亡的發(fā)生，保護骨髓間充質(zhì)干細胞[30]。

1.4細胞鐵死亡的機制研究 鐵逐漸被認為是細胞鐵死亡的重要啟動劑[31]，而鐵螯合劑可抑制細胞鐵死亡[9]。鐵死亡的啟動依賴脂質(zhì)過氧化反應(yīng)累積ROS[23]。研究表明，細胞鐵死亡的關(guān)鍵介質(zhì)是鐵代謝與脂質(zhì)過氧化[32-33]。

1.4.1鐵代謝 鐵是哺乳動物體內(nèi)必需的微量元素，在活細胞和生物體內(nèi)起重要作用，參與許多生物過程，包括整個細胞周期、能量產(chǎn)生、生物合成、復(fù)制和運動，甚至基因表達的調(diào)控等[34]。缺鐵會導(dǎo)致貧血，而鐵過量則會增加肝病、心臟病、糖尿病甚至惡性腫瘤的患病風(fēng)險[35]。鐵死亡通常與鐵穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)，鐵超載是鐵死亡的關(guān)鍵因素之一，過量的鐵參與提供超氧化物并完成脂質(zhì)過氧化過程[32]。調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)蛋白表達的經(jīng)典系統(tǒng)為鐵調(diào)節(jié)蛋白/鐵反應(yīng)元件，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1、Fe2+轉(zhuǎn)運體蛋白1以及鐵蛋白等，均參與鐵的提取、儲存和流出的整個過程[32-33]。細胞鐵主要以Fe2+或Fe3+形式儲存于細胞中，F(xiàn)e3+以非轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵或轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的形式進入質(zhì)膜，非轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵在質(zhì)膜表面被還原為Fe2+，并被Fe2+轉(zhuǎn)運體蛋白1或鋅鐵調(diào)控蛋白14轉(zhuǎn)載至胞質(zhì)，而轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵在吞飲小泡的作用下釋放Fe3+并將其還原為Fe2+，同樣通過Fe2+轉(zhuǎn)運體蛋白1轉(zhuǎn)載至胞質(zhì)中[36]。Fe2+匯聚于鐵池中，其中一部分形成含鐵蛋白或以鐵蛋白的形式存儲，正常情況下，機體通過維持Fe2+的動態(tài)平衡保持穩(wěn)態(tài)；病理情況下，過多的Fe2+通過Fenton反應(yīng)與過氧化氫相互作用，引發(fā)多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使ROS積聚，最終導(dǎo)致鐵死亡[37]。另有研究指出，一種存在于線粒體外膜的通道構(gòu)成蛋白——電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels，VDACs)可通過膜電位的改變而開放外膜通道(允許鐵和代謝物通過)，erastin則通過介導(dǎo)VDAC2或VDAC3開放線粒體外膜通道增加鐵攝取，進而加速鐵死亡進程[38-40]。

1.4.2脂質(zhì)過氧化 脂質(zhì)過氧化在增加細胞脂質(zhì)毒性并誘導(dǎo)細胞鐵死亡的進程中起關(guān)鍵作用。有報道稱，erastin可引發(fā)GSH消耗和GPX4失活，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和細胞死亡[41]。GPX4作為一種抗氧化酶，既可在復(fù)雜的質(zhì)膜環(huán)境下催化GSH轉(zhuǎn)化為氧化型GSH，又可消除細胞代謝產(chǎn)物過氧化物和羥基自由基，減輕質(zhì)膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[37,41-42]。

目前已報道了兩種鐵死亡觸發(fā)機制：①抑制system Xc-，同時抑制胞內(nèi)半胱氨酸和GSH，作為GPX4的輔助因子，GSH同時參與過氧化物酶反應(yīng)循環(huán)，因此，抑制system Xc-可間接抑制GPX4，導(dǎo)致致死性過氧化脂質(zhì)積聚，啟動鐵死亡進程；②利用小分子抑制劑與GPX4活性位點的共價作用抑制GPX4活性，導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平上升到一定高度，觸發(fā)鐵死亡[5]。

2 鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，細胞鐵死亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病、肝病、胃腸道疾病、肺部疾病、腎臟疾病、胰腺疾病中起重要作用[43-56]。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因在于骨代謝異常，其中骨穩(wěn)態(tài)破壞是關(guān)鍵，即成骨細胞介導(dǎo)的骨形成減少和破骨細胞驅(qū)動的骨破壞增加。鐵死亡的顯著特征包括細胞內(nèi)鐵超載和ROS的大量堆積。

2.1鐵超載 鐵離子是細胞色素氧化酶的重要組成部分，參與機體血液內(nèi)氣體循環(huán)及脂質(zhì)的運輸?shù)龋^量的鐵具有毒性作用。有研究指出，鐵超載是骨質(zhì)疏松癥的一個危險因素[57]。細胞鐵超載狀態(tài)打破了骨形成與骨破壞的平衡，即骨平衡狀態(tài)破壞，而骨質(zhì)弱化是鐵超載狀態(tài)的共同特征之一，表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變、頻繁骨折等[58]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展與鐵超載程度呈正相關(guān)[59]。鐵超載可在一定程度上抑制成骨細胞的活性，影響其分化和礦化進程，同時激活破骨細胞的活化和分化，造成骨流失[60-61]，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。

鐵超載誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥在動物模型及臨床中均有研究。長期給予右旋糖酐鐵的小鼠具有部分組織鐵超載和骨質(zhì)疏松癥的表現(xiàn)[62]。有報道顯示，除雌激素缺乏外，絕經(jīng)后女性還表現(xiàn)出鐵超載征象，這可能是老年女性易患骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因素；鐵螯合劑可有效抑制鐵聚集和破骨細胞分化，減少骨破壞，改善骨組織微結(jié)構(gòu)，防止骨丟失[57]。由此可見，鐵超載可影響骨代謝平衡，誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。而控制鐵超載可以在一定程度上維護鐵穩(wěn)態(tài)的平衡，有可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的有效手段之一。

2.2ROS的累積 ROS在鐵死亡相關(guān)骨質(zhì)疏松癥中起重要作用。線粒體是ROS的主要來源，線粒體電子轉(zhuǎn)移機制是ROS形成的主要方式。ROS是正常細胞內(nèi)線粒體代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要包括羥基、過氧化氫等。一般情況下，ROS可以被機體內(nèi)抗氧化酶(如GSH、GPX)清除，ROS的生成與清除可維持ROS的平衡狀態(tài)。鐵超載可誘導(dǎo)ROS累積，即自由鐵通過Fenton反應(yīng)催化ROS形成[63]。ROS在一定程度上參與了成骨細胞的分化和線粒體的形態(tài)轉(zhuǎn)化，而過多ROS生成使正常的骨重建過程轉(zhuǎn)變?yōu)楣莵G失的病理過程，即骨吸收增加、骨形成減少[64-65]。

有報道稱，降低ROS水平是抑制破骨細胞分化的重要因素之一，提示ROS在一定程度上刺激了破骨細胞的形成與分化[66]。Chen等[67]報道，通過降低ROS水平可以抑制去卵巢小鼠破骨細胞的產(chǎn)生，防止雌激素缺乏引起的骨丟失。Liu等[68]通過實驗首次證實，Loureirin B可通過抑制ROS活性直接抑制破骨細胞的產(chǎn)生，進而防止卵巢切除術(shù)后的骨丟失。綜上可知，ROS可影響骨代謝平衡，在骨質(zhì)疏松癥進展中的起到關(guān)鍵作用，但目前具體機制尚不明確。

鐵死亡是鐵依賴的細胞死亡形式，骨質(zhì)疏松癥與鐵死亡密切相關(guān)。鐵超載以及ROS的大量堆積是鐵死亡的顯著特征。鐵死亡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要組成部分，骨質(zhì)疏松患者常合并鐵超載和ROS累積，進一步研究鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系有望改善臨床骨質(zhì)疏松癥患者的預(yù)后。

3 問題與展望

目前對于鐵死亡的認識尚不全面。在鐵死亡的分子機制方面，鐵和ROS是鐵死亡信號通路中的重要因素，該過程的其他潛在分子機制以及除Fenton反應(yīng)外介導(dǎo)線粒體中ROS積累的其他機制仍需進一步研究。目前對骨質(zhì)疏松癥的研究主要集中于鐵超載和ROS的產(chǎn)生方面，對鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥的內(nèi)在聯(lián)系尚未深入研究。中藥成分(如黃芩素[69]、青蒿琥酯[70]、槲皮素[30])可以調(diào)控鐵死亡，但其具體作用機制目前尚不清楚。其他中藥單體在鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用還有待進一步探討?？傊?，深入研究鐵死亡有助于進一步分析骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制，為預(yù)防和臨床治療臨床骨質(zhì)疏松癥治療提供依據(jù)。