周澤紅，譚家余，黃湘

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院檢驗科，廣東 中山 528400；3.中山市博愛醫(yī)院中心ICU，廣東 中山 528403；4.佛山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東 佛山 528300)

呼吸機相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)是指患者接受機械通氣48 h后發(fā)生的感染性炎癥，診斷和治療較為困難，發(fā)病率和病死率均較高[1]。一項國內(nèi)多中心、觀察性的流行病學(xué)研究顯示，VAP的發(fā)病率為4.5例/1 000機械通氣日，28 d死亡率高達45%[2]。目前VAP的診斷方法包括臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床肺部感染評分、病原微生物培養(yǎng)、急性生理學(xué)和慢性健康狀況評價Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)等，然而這些方法均存在不足之處。VAP的發(fā)生極大地危害患者的生命健康，若不能盡早診斷、盡早規(guī)范治療將嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。生物標(biāo)志物檢測具有快速、高效的優(yōu)勢，可用于VAP的早期診斷和鑒別診斷。現(xiàn)已證明血清生物標(biāo)志物如C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)對下呼吸道感染的診斷具有較高的靈敏度，但在VAP的鑒別診斷方面特異度較低[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中生物標(biāo)志物如可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)、穿透素-3(pentraxin 3，PTX3)的檢測能提高VAP早期診斷的準(zhǔn)確性，改善患者預(yù)后[6-7]?，F(xiàn)就目前臨床常用的BALF生物標(biāo)志物的研究進展進行綜述。

1 傳統(tǒng)生物標(biāo)志物

1.1CRP CRP是系統(tǒng)性炎癥的急性期標(biāo)志物，也可能是肺部免疫系統(tǒng)的局部調(diào)節(jié)劑，連續(xù)監(jiān)測CRP水平已被廣泛用于感染性疾病的診斷和療效觀察[8]。因BALF標(biāo)本來源部位的特異性，檢測BALF中CRP對VAP的診斷具有一定幫助并可聯(lián)合其他生物標(biāo)志物提高VAP的診斷效能；且經(jīng)動態(tài)監(jiān)測BALF發(fā)現(xiàn)CRP水平變化與疾病進程相關(guān)，即在確診VAP時達峰值，隨著病情的好轉(zhuǎn)而呈下降趨勢[9]。同時，CRP可聯(lián)合其他炎癥標(biāo)志物如PCT、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)用于VAP的早期診斷和療效觀察[10]。因此，CRP對VAP的診治具有重要價值。

1.2PCT PCT已被證實為細(xì)菌性感染的早期預(yù)測和療效觀察指標(biāo)，已普遍用于細(xì)菌性感染性疾病的診斷和預(yù)后評估。多個團隊的研究結(jié)果顯示，BALF中PCT診斷VAP的靈敏度可達55%以上，特異度在80%以上，且其濃度呈現(xiàn)隨疾病的加重而升高、隨疾病好轉(zhuǎn)而降低的變化趨勢，提示BALF中PCT的檢測對VAP早期診斷及預(yù)后評估具有較高的應(yīng)用價值[11-15]。但丁磊和王振洲[16]研究發(fā)現(xiàn)，疑診VAP組、確診VAP組及無VAP組患者BALF中PCT及CRP水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而血清PCT、CRP水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，血清PCT、CRP可作為VAP的早期診斷指標(biāo)。上述多項研究結(jié)果和結(jié)論差異較大的原因：①PCT的檢測方法不同；②BALF標(biāo)本采集前未排除抗生素的影響；③研究樣本量不同以及BALF標(biāo)本質(zhì)量的差異。雖然研究結(jié)果存在爭議，但綜合評估后發(fā)現(xiàn)血清和肺泡灌洗液PCT對于VAP的早期診斷、療效觀察和預(yù)后評估仍具有潛在的應(yīng)用價值。

1.3TNF-α TNF-α是早期炎癥因子，由單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活后產(chǎn)生，具有廣泛的作用。TNF-α是肺炎早期發(fā)生發(fā)展中主要的促炎因子，引起白細(xì)胞在炎癥部位聚集，早期具有一定的保護作用，一旦炎癥的促炎和抑炎平衡被打破產(chǎn)生失控的炎癥風(fēng)暴就會引起肺損傷。經(jīng)動物實驗證實，在VAP的發(fā)生發(fā)展中，病原體可能通過Toll樣受體、病原體相關(guān)分子模式通路和(或)核因子κB信號通路激活肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF-α破壞促炎和抑炎的平衡，從而募集中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞聚集造成肺損傷，且銅綠假單胞菌菌液滴注誘導(dǎo)VAP后小鼠肺組織中TNF-α以及肺泡灌洗液中TNF-α水平顯著升高[17-18]。在豬VAP模型的動物實驗研究中，BALF和氣道分泌物培養(yǎng)對VAP的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，且聯(lián)合TNF-α檢測能顯著提高VAP的診斷準(zhǔn)確性[19]。程紅斌[20]研究發(fā)現(xiàn)，VAP患兒急性期血清TNF-α水平高于恢復(fù)期和正常對照組患兒，BALF中TNF-α水平高于血清TNF-α水平，表明TNF-α作為一種早期的炎癥因子參與VAP的發(fā)生發(fā)展過程。因此，BALF中TNF-α可作為VAP早期診斷和疾病預(yù)后的指標(biāo)。

1.4IL

1.4.1IL-6 IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在急性期炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和造血中發(fā)揮重要作用，其在感染性疾病、免疫性疾病及腫瘤等疾病中表達增加。血清IL-6可作為VAP患者預(yù)后的標(biāo)志物，并且在維生素D治療后逐漸降低，以減輕炎癥損傷[21]。VAP患者肺部IL-6表達升高的機制可能是病原體通過c-Jun氨基端激酶信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而實現(xiàn)[22]。史躍杰和陳麗敏[23]檢測63例新生兒VAP患兒血清和BALF中IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α水平,并按照患兒預(yù)后情況分為預(yù)后良好組(41例)和預(yù)后不良組(22例)，發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組患兒BALF中IL-6、IL-8明顯高于預(yù)后良好組，而抑炎因子IL-2水平明顯低于預(yù)后良好組。由此證實，BALF中IL-6水平有助于評估VAP患者的預(yù)后。臨床醫(yī)師可通過檢測BALF中IL-6和IL-8水平，評估VAP患兒預(yù)后情況，及時調(diào)整治療方案，改善患兒預(yù)后。

1.4.2IL-1β IL-1β是常見的促炎因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞分泌，肺部感染時，IL-1β誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞的趨化形成炎癥風(fēng)暴，進而引起肺損傷。IL-1β在呼吸機相關(guān)性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在呼吸機相關(guān)性肺損傷大鼠模型中證實，呼吸機相關(guān)性肺損傷大鼠的血清和BALF中IL-1β水平顯著升高，并且隨著抗炎藥物的治療和病情好轉(zhuǎn)后逐漸下降[24]，因此，檢測BALF中IL-1β水平對VAP的早期診斷具有較大幫助且能作為療效觀察指標(biāo)。Morris等[25]通過分析BALF中多種炎癥標(biāo)志物濃度發(fā)現(xiàn)，以10 pg/mL為臨界值時，IL-1β診斷VAP的陰性似然比為0.09；以 2 ng/mL為臨界值時，BALF中IL-8診斷VAP的陽性似然比可達5.03，BALF中IL-1β、IL-8是目前VAP鑒別診斷的最強標(biāo)志物。這一發(fā)現(xiàn)對VAP患者抗生素的管理具有潛在的應(yīng)用價值。

1.4.3IL-8 IL-8是單核-巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞受感染、炎癥等刺激而分泌的趨化因子，對中性粒細(xì)胞具有較強的趨化作用，在肺部感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[26]。BALF中IL-8的檢測在成人和新生兒VAP的診斷中均展現(xiàn)出較好的應(yīng)用價值，鄧毅等[27]對新生兒VAP與非VAP患兒BALF和血清IL-1、IL-6、IL-8等炎癥標(biāo)志物檢測發(fā)現(xiàn)，兩組通氣48、96 h BALF中上述炎癥標(biāo)志物比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并隨著時間的推移各炎癥標(biāo)志物在VAP組BALF中逐漸升高，其中IL-8變化最顯著。由此可見，IL-8可作為新生兒VAP的診斷指標(biāo)。

IL-8的檢測還可用于VAP的排除性診斷，并指導(dǎo)抗生素管理，即早期檢測到VAP患者BALF中IL-1β、IL-8水平低于設(shè)定的閾值時停用抗生素。Hellyer等[28]對12個重癥監(jiān)護病房、大樣本量的研究證實IL-1β是較好的VAP預(yù)測指標(biāo)，并且發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測IL-1β、IL-8對VAP排除性診斷的靈敏度為100%，特異度為44.3%，測試后概率為0%。根據(jù)這一結(jié)果該團隊隨后提出假設(shè)：若BALF中IL-1β、IL-8低于之前設(shè)定的診斷臨界值，能減少抗生素的使用，并于2013年注冊實施了17個醫(yī)院、24個重癥監(jiān)護病房的多中心雙盲隨機對照試驗對該假設(shè)加以證實[29]。但IL-8等炎癥標(biāo)志物在VAP患者抗生素管理方面的作用需要更多隨機對照試驗加以驗證。

1.5中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) NE是絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，來源于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞。在VAP的病理機制中，中性粒細(xì)胞大量聚集于肺泡并釋放大量的NE等蛋白水解酶，NE是重要的炎癥損傷因子，是引起急性肺損傷炎癥級聯(lián)反應(yīng)的主要終效應(yīng)因子，其主要通過消化和降解細(xì)胞外基質(zhì)及上皮連接結(jié)構(gòu)導(dǎo)致肺損傷。在VAP患者BALF中觀察到NE的質(zhì)量和活力均顯著升高，以670 ng/mL為臨界值，NE診斷VAP的靈敏度為93%、特異度為79%[30]。BALF中NE水平與VAP的進展具有相關(guān)性，在未發(fā)生VAP前血清和BALF中NE水平較低，發(fā)生VAP時血清和BALF中NE水平顯著增高，隨著治療進行和病情好轉(zhuǎn)，血清和BALF中NE水平下降，但在病情惡化和死亡患者血清和BALF中NE持續(xù)升高；且BALF中NE水平與臨床肺部感染評分、血清CRP、PCT以及全血白細(xì)胞呈正相關(guān)，提示BALF中NE的檢測對于VAP的診斷、療效觀察和預(yù)后評估具有較高的應(yīng)用價值[31]。NE水平和活性增加而NE抑制劑濃度和活性下降導(dǎo)致肺炎患者難以康復(fù)，NE抑制劑的應(yīng)用能改善此狀況、促進細(xì)胞因子的適量釋放及病原菌的清除[32]。提示NE可作為VAP治療的新靶標(biāo)。

2 新型生物標(biāo)志物

2.1sTREM-1 sTREM-1是表達于中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞表面的受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，可在血液以及體液中檢測到。sTREM-1是近年來發(fā)現(xiàn)的感染性疾病早期診斷的敏感性指標(biāo)，機械通氣72 h后發(fā)生VAP的患者血清sTREM-1水平顯著高于非VAP患者，以165.05 pg/mL為臨界值時，機械通氣72 h的sTREM-1診斷VAP的靈敏度為90%，聯(lián)合PCT檢測能顯著提高診斷的靈敏度和特異度，因此血清sTREM-1可作為VAP的可靠預(yù)測指標(biāo)[33]。BALF中sTREM-1水平診斷VAP的靈敏度和特異度均高于血清CRP、PCT和sTREM-1，而且sTREM-1水平與APACHEⅡ評分均可評估患者預(yù)后[34]。BALF中sTREM-1作為VAP的早期預(yù)測指標(biāo)在兒童VAP人群中也展現(xiàn)出較高的應(yīng)用價值[35]。BALF中sTREM-1在成人和兒童VAP的診斷中均展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，且sTREM-1刺激劑為脂多糖，預(yù)示著sTREM-1水平可能與細(xì)菌的種屬有關(guān)，但需更多高質(zhì)量的研究加以驗證，以使臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化。

2.2PTX3 PTX3是由381個氨基酸殘基組成的五肽相關(guān)蛋白，屬于五聚蛋白家族的急性期蛋白，由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞等組織細(xì)胞合成和分泌，常參與機體早期的抗感染反應(yīng)及異物清除。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，血清PTX3水平在感染、炎癥等情況下會顯著升高[36-37]。一項納入961例樣本的Meta分析結(jié)果顯示，PTX3診斷呼吸道感染的綜合靈敏度為0.78、特異度為0.73，綜合受試者工作特征曲線下面積為0.84；亞組分析顯示血清和BALF中PTX3診斷呼吸道感染的綜合受試者工作特征曲線下面積分別為0.85和0.89，PTX3診斷VAP的綜合受試者工作特征曲線下面積可達0.89，表明PTX3診斷呼吸道感染及VAP具有中等的診斷準(zhǔn)確性，BALF中PTX3的總診斷價值優(yōu)于血清[38]。因此，BALF中PTX3的檢測有助于VAP的早期診斷。

2.3淀粉酶 誤吸是機械通氣患者發(fā)生VAP的重要致病機制，包括口咽部分泌物和胃內(nèi)容物的誤吸?？谘什糠置谖镏械矸勖笧橥僖旱矸勖福竷?nèi)容物中的淀粉酶可能來自胰腺，因此無論口咽部分泌物誤吸還是胃內(nèi)容物誤吸，BALF中均有可能檢測到淀粉酶水平升高。Samanta等[39]研究發(fā)現(xiàn)，插管后72 h內(nèi)發(fā)生VAP的患者盲法BALF淀粉酶水平顯著升高，并隨插管前、插管后誤吸風(fēng)險因素的增加而增加。Qu等[40]對147例機械通氣超過2周的老年患者氣道分泌物淀粉酶進行檢測后也得出相似的結(jié)論。淀粉酶作為快速靈敏的指標(biāo)，已達到自動化分析的程度，對具有誤吸風(fēng)險的VAP患者的診治具有重要意義。

2.4肝素結(jié)合蛋白(heparin-binding protein，HBP) HBP又稱為天青殺素，是來源于多形核白細(xì)胞的重要顆粒蛋白，在炎癥過程中大量釋放并具有殺菌、趨化及調(diào)節(jié)作用。健康人血清中HBP水平較低，一般不超過10 μg/L，發(fā)生感染時，菌體本身或細(xì)菌釋放的毒素等物質(zhì)刺激中性粒細(xì)胞釋放HBP，從而導(dǎo)致HBP水平升高[41-42]。血清HBP對感染性疾病的診斷具有較高的敏感性和特異性，血清HBP水平升高也有助于VAP的診斷和預(yù)后評估，并且HBP聯(lián)合APACHEⅡ評分早期診斷VAP的診斷價值優(yōu)于PCT聯(lián)合APACHEⅡ[43]。但BALF中HBP檢測對VAP診斷的研究較少見報道，其原因可能為標(biāo)本采集較困難。

2.5胰石蛋白 胰石蛋白由胰腺腺泡細(xì)胞合成和分泌，是胰腺的分泌產(chǎn)物，以可溶形式分布于生理狀態(tài)的胰腺組織、胰液和血清中，其生物學(xué)作用尚不清楚，被證實在感染性疾病特別是ICU膿毒癥患者診斷和預(yù)后研究中具有較高的應(yīng)用價值[44]。血清中胰石蛋白水平能作為VAP的診斷指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)[45]，梁添書等[46]連續(xù)監(jiān)測疑診VAP患者第1、4、7、14天及停呼吸機時血清胰石蛋白水平發(fā)現(xiàn)胰石蛋白水平隨VAP的進展而升高，治療后濃度下降，因此胰石蛋白可作為VAP診斷和預(yù)后評估指標(biāo)。BALF中胰石蛋白的檢測有助于VAP的早期診斷，且BALF中胰石蛋白診斷VAP的受試者工作特征曲線下面積可達0.91，具有較高的靈敏度和特異度[47]。胰石蛋白除在胰腺中高表達外，在肝、腎、腦和肺中也存在高表達，且肺組織是其主要表達區(qū)域[48]。因此，BALF中的胰石蛋白可作為VAP的早期診斷指標(biāo)。

2.6肺泡表面活性物質(zhì)蛋白D(alveolar surface active substance protein D，SP-D) SP-D是一種豐富的肺表面活性劑相關(guān)蛋白，在肺的局部防御和免疫調(diào)節(jié)等過程中起重要作用，可與多種肺病原體結(jié)合，增強肺部調(diào)理作用而清除病原體。SP-D不僅可增強固有免疫細(xì)胞對病原體的清除，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答并與多種肺部疾病密切相關(guān)。王鸝鸝等[49]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎患兒BALF中SP-D水平顯著升高，且與BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，提示SP-D作為一種保護性因子在調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

SP-D是新進發(fā)現(xiàn)的肺部特異性標(biāo)志物，診斷肺部疾病的特異性較高，在VAP的診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。Said等[50]通過檢測兒科機械通氣患兒BALF中SP-D并計算臨床肺部感染評分發(fā)現(xiàn)，BALF培養(yǎng)陽性患兒BALF中SP-D水平顯著高于培養(yǎng)陰性組患兒；與感染肺炎克雷伯菌或金黃色葡萄球菌的患兒相比，感染銅綠假單胞菌的患兒SP-D水平增加更顯著，SP-D水平與細(xì)菌種屬相關(guān)；BALF中SP-D水平升高先于臨床肺部感染評分和BALF培養(yǎng)結(jié)果變化。Tekerek等[51]對成人VAP和非VAP患者血清中CRP、PCT、PTX3和SP-D水平進行比較發(fā)現(xiàn)，血清SP-D是診斷VAP最敏感的生物標(biāo)志物，可作為鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的早期特異性生物標(biāo)志物。

3 生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測

單個生物標(biāo)志物檢測對VAP診斷的敏感性和特異性均不能滿足臨床需求，易出現(xiàn)漏診情況，因此，主張多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測。Grover等[52]通過比較確診VAP、非VAP、無機械通氣無感染患者BALF和血清中多項生物標(biāo)志物水平的差異，篩選并構(gòu)建了包含BALF單核細(xì)胞表面髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1與血清單核細(xì)胞表面髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1比值、BALF單核細(xì)胞表面人整合素AM(mCD11b)與血清單核細(xì)胞表面人整合素AM(mCD11b)比值、BALF sTREM-1、IL-8、IL-1β以及血清CRP、IL-6的7項生物標(biāo)志物的組合模型，該模型能準(zhǔn)確鑒別出VAP患者。Antcliffe等[53]檢測VAP患者血清中包含細(xì)胞因子、氧化脂類等51種炎癥標(biāo)志物的結(jié)果顯示，5,6-二羥基二十碳三烯酸、8,9-二羥基二十碳三烯酸、細(xì)胞間黏附分子-1、IL-6和IL-8的多元模型可以鑒別VAP患者與無感染的腦損傷患者，標(biāo)志物聯(lián)合檢測VAP的診斷價值更高。

4 小 結(jié)

BALF中生物標(biāo)志物可反映肺部炎癥的嚴(yán)重程度，對VAP的早期診斷和預(yù)后評估具有較高的應(yīng)用價值。但生物標(biāo)志物檢測受BALF標(biāo)本質(zhì)量、抗生素、檢測方法的影響，因此，后續(xù)研究應(yīng)由專業(yè)熟練的醫(yī)師采集BALF標(biāo)本、統(tǒng)一檢測方法、排除抗生素對各個標(biāo)志物檢測的影響，增加樣本量以及采用隨機對照試驗的方法對BALF生物標(biāo)志物在VAP診治中的應(yīng)用價值加以證實。VAP患者BALF中多種生物標(biāo)志物濃度顯著升高，但其升高的具體機制尚未清楚，且各個標(biāo)志物的檢測尚未標(biāo)準(zhǔn)化。若能解決以上兩個問題，BALF中生物標(biāo)志物有望成為VAP診斷、療效觀察及預(yù)后評估的重要指標(biāo)。