侯宏彬，劉光華，吳振起，任園園，湯玉梅，鐘潤(rùn)鋒

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，遼寧 沈陽 110032)

流感即流行性感冒是流感病毒引起的一種常見的呼吸道傳染性疾病。近年來爆發(fā)流行的H5N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、甲型H1N1禽流感病毒都表現(xiàn)出發(fā)病時(shí)間短、傳變速度快、易造成廣泛流行的特點(diǎn)，流感病毒易突變的特性也使疫苗與相關(guān)藥物的研制滯后，因而其流行變得更加頻繁，嚴(yán)重威脅人們的健康。

甘露消毒丹是中醫(yī)學(xué)中運(yùn)用芳香藥物治療流感的代表方劑，首見于葉天士的《醫(yī)效秘傳》，甘露消毒丹中的芳香藥物有石菖蒲、廣藿香、薄荷、蔻仁、茵陳，具有芳香辟穢、開竅化濁、宣肺通絡(luò)、醒脾和胃之效。

1 資料與方法

1.1 獲取芳香中藥的化學(xué)成分

通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)網(wǎng)站查詢獲得上述芳香藥物的化學(xué)成分。

1.2 篩選藥物的有效成分

根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物的有效成分[1]。

1.3 獲取上述芳香藥物的有效成分及靶點(diǎn)信息與流感的靶點(diǎn)并預(yù)測(cè)潛在的作用靶點(diǎn)

采用TCMSP平臺(tái)獲取上述芳香藥物的有效成分及靶點(diǎn)信息并加以分析整理。在GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“influenza”并檢索，獲得與流感相關(guān)的靶點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)性得分篩選，保留得分大于1.5的流感潛在的作用靶點(diǎn)[2]。在Draw Venn Diagram網(wǎng)站將上述芳香藥物的有效成分靶點(diǎn)與流感潛在的作用靶點(diǎn)在線繪制成Venn圖，通過繪制Venn圖獲得交集靶點(diǎn)。兩者的交集靶點(diǎn)即為上述芳香藥物治療流感的潛在靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入上述交集靶點(diǎn)，將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)種類限定為智人，其他項(xiàng)目保留默認(rèn)設(shè)置，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將靶點(diǎn)間相互關(guān)系的數(shù)據(jù)結(jié)果以TSV文件格式保存，并應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件中的“Network Analysis”功能加以分析。根據(jù)度值及介數(shù)值對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選，將兩個(gè)參數(shù)都高于平均值的靶點(diǎn)選為關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 繪制“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”圖

利用Cytoscape3.7.2軟件將中藥名、有效成分及其潛在的作用靶點(diǎn)繪制成“中藥-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，Degree值越大，則與該節(jié)點(diǎn)相關(guān)的節(jié)點(diǎn)越多。圖中的圖形大小與Degree值成正相關(guān)。

1.6 對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)及基因組百科全書(KEGG)富集分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)輸入關(guān)鍵靶基因，物種選擇為智人，對(duì)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO 富集分析與KEGG富集分析，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能及信號(hào)通路，并輸出結(jié)果。利用微生信網(wǎng)站(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制相應(yīng)的富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得上述芳香藥物的成分共487個(gè)。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18對(duì)成分進(jìn)行篩選，剔除無效成分，共得到47個(gè)有效成分。將中藥及關(guān)鍵有效成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯ㄟ^介數(shù)中心排列，獲得其中最高的3種有效成分，分別為槲皮素(MOL000098，quercetin)、芫花素(MOL005573，Genkwanin)及木犀草素(MOL000006，luteolin)。

2.2 構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)Venn圖

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索上述芳香藥物中化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，除去重復(fù)的靶點(diǎn)，共獲得224個(gè)藥物有效作用靶點(diǎn)。在 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索流感相關(guān)作用靶點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)性得分對(duì)其進(jìn)行篩選，得到作用靶點(diǎn)1 326個(gè)。對(duì)有效藥物作用靶點(diǎn)及流感相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析，得出上述芳香藥物作用于流感的相關(guān)作用靶點(diǎn)78個(gè)。見圖1。

圖1 Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將78個(gè)相關(guān)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，建立靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系由1 395條連線表示，線條越粗表示具有越強(qiáng)的相互作用，結(jié)果以TSV格式保存。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

在Cytoscape 3.7.2軟件中導(dǎo)入上述TSV格式文件，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩缘姆治?，度值的平均值?5.77，介數(shù)的平均值為7.23×10-3，篩出度值、介數(shù)值均高于平均值的靶點(diǎn)共24個(gè)。將篩選獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。網(wǎng)絡(luò)中連接其他靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)起關(guān)鍵作用。將甘露消毒丹中的芳香藥物及其含有的有效成分及24個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建成“中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”交互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。圖3顯示出多個(gè)中藥作用于一個(gè)靶點(diǎn)、一個(gè)化學(xué)成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)中藥成分作用于一個(gè)靶點(diǎn)等特征，這表明甘露消毒丹中的芳香藥物是通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同的作用達(dá)到防治流感的效果。

2.5 GO富集與KEGG通路富集分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)輸入24個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)其采取GO富集分析與KEGG富集分析。GO富集分析共獲得GO Biological Processes條目967條，GO Cellular Components條目28條，GO Molecular Functions條目46條，根據(jù)P<0.05，選取每種條目的前10條建立富集分析條形圖(見圖4)。KEGG富集分析共獲得相關(guān)分子通路114條，根據(jù)P<0.05，選取前20條的相關(guān)分子通路構(gòu)建富集氣泡圖(見圖5)。

圖3 “中藥-有效成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 GO 富集條形圖

圖5 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

本課題得出甘露消毒丹中芳香藥物的有效化學(xué)成分45種，其中，槲皮素、芫花素、木犀草素最為關(guān)鍵。研究[3]發(fā)現(xiàn)，槲皮素能減少甲型H1N1病毒感染后Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡作用。實(shí)驗(yàn)研究[3-4]表明，槲皮素能有效抑制流感病毒在呼吸系統(tǒng)的復(fù)制，降低肺部炎癥水平，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，緩解血清中的炎癥狀態(tài)。芫花素具有抗炎作用及鎮(zhèn)痛作用[5]，能緩解流感的炎癥表現(xiàn)及周身酸痛的癥狀。木犀草素是一種天然類黃酮，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制氧化、抗炎、抗病毒等多種功效，能通過調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)起到抗炎與抗流感病毒的作用，并能通過抑制細(xì)胞凋亡減少病毒的免疫損傷[6]。

對(duì)藥物與疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行篩選后共獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)24個(gè)，涉及的靶點(diǎn)主要與流感病毒的感染、復(fù)制，以及炎癥反應(yīng)的激活與調(diào)節(jié)有關(guān)。其中，IL-6、IL-8、TNF是流感病毒感染過程中單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞被激活產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，其功能主要是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成炎癥損傷[7]。IL-6、TNF-α是重要的炎癥因子，能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞中CD11b/CD18、CD11c/CD18表達(dá)水平的提高，并促進(jìn)白細(xì)胞的炎癥滲出，還能作為內(nèi)源性致熱源，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，從而引起發(fā)熱[8]。IL-10可通過減少促炎因子的釋放，減少過度炎癥反應(yīng)造成的損傷[7]。IL1B的遺傳變異可能與流感的易感性相關(guān)[9]。CCL2是H7N9禽流感病毒感染后可介導(dǎo)包括急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在內(nèi)的急性肺損傷的重要蛋白[10]。CXCL8、IL-8在肺上皮細(xì)胞感染病毒后釋放，可能有利于吸引中性粒細(xì)胞以迅速清除壞死碎片，從而防止細(xì)菌感染發(fā)生[11]。表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)在IAV進(jìn)入過程中不可或缺[12]。EGFR的下游信號(hào)可介導(dǎo)凝血途徑及肺B細(xì)胞下調(diào)，與高致病性流感感染的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。STAT1是流感病毒的早期復(fù)制及炎癥反應(yīng)中的重要蛋白，并參與了病毒vRNA的合成[14]。JUN是編碼c-jun的基因[15]，c-jun可被JNK磷酸化，并與c-fos構(gòu)成二聚體，即AP-1。轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1 (Transcription factor AP-1)的表達(dá)可參與調(diào)節(jié)IL-6、IFN、ICAM1等多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，在流感病毒感染早期有促進(jìn)病毒感染及復(fù)制的作用[15-16]。Caspase-3 則是介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的關(guān)鍵蛋白[3]。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上述芳香藥物治療流感的基因功能主要涉及對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等生物學(xué)過程，膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔、小窩、質(zhì)膜筏等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體調(diào)節(jié)劑活性、核心啟動(dòng)子結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子功能。這些生物學(xué)過程及分子功能多數(shù)與病原體引起的免疫反應(yīng)及其介導(dǎo)的炎癥因子風(fēng)暴關(guān)系密切。由KEGG通路富集分析得出，甘露消毒丹中芳香藥物治療流感的重要通路有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥通路等，主要與病毒的感染、復(fù)制，以及炎癥反應(yīng)的激活有關(guān)。其中，IL-17是一種由Th17細(xì)胞分泌的強(qiáng)炎癥因子，可介導(dǎo)多種炎癥因子及趨化因子的活化，并能通過促進(jìn)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生介導(dǎo)呼吸道平滑肌細(xì)胞分泌IL-6，激活中性粒細(xì)胞并使其成熟[17-18]。IL-17在炎癥細(xì)胞的組織浸潤(rùn)及誘導(dǎo)肺部損傷中起重要作用[17]。流感病毒入侵呼吸道上皮細(xì)胞后介導(dǎo)促炎因子TNF-α的分泌，從而使IL-6的分泌也隨之增加，二者被認(rèn)為是炎癥因子風(fēng)暴中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[19]。TNF-α的增多可介導(dǎo)白細(xì)胞遷移、激活肺內(nèi)皮細(xì)胞，并使粒細(xì)胞脫顆粒。IL-6可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞增殖，介導(dǎo)更多炎癥因子產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)[19]。TLRs是一種最早發(fā)現(xiàn)的PRRs，可識(shí)別多種不同的病原體相關(guān)分子模式(Pathogen assciated molecular patterms，PAMPs)。肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞通過TLRs介導(dǎo)流感病毒ssDNA的識(shí)別，進(jìn)而激活相關(guān)的抗病毒機(jī)制及免疫應(yīng)答[20]。TLRs識(shí)別PAMPs后誘導(dǎo)Toll/白細(xì)胞介素1受體活化，并與髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)發(fā)生相互作用。MyD88能吸引白介素相關(guān)激酶4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4)，與TLRs共同作用，誘導(dǎo)IRAK-1的活化，進(jìn)而激活腫瘤壞死因子相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)，并進(jìn)一步導(dǎo)致IκB激酶與NF-κB活化[21]。被激活的下游轉(zhuǎn)錄因子與信號(hào)分子可介導(dǎo)微生物分子、細(xì)胞因子、趨化因子、共刺激分子的產(chǎn)生[21]。NOD樣受體(NODs)是一類主要存在于細(xì)胞胞漿中的重要PRRs，其中，NLR蛋白3是一種與病毒感染相關(guān)，且被深入研究的NOD樣受體。NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3蛋白、ASC蛋白及Caspase-1前體構(gòu)成的蛋白質(zhì)復(fù)合體，能誘導(dǎo)Caspase-1前體的剪切與活化，進(jìn)而將Pro-IL-1β、Pro-1L-18、Pro-IL-33活化為IL-1β、IL-18、IL-33[21]。NLRP3炎癥小體通路能造成細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)、引起細(xì)胞因子風(fēng)暴[22]。MAPK信號(hào)通路的主要分支包括EBK、p38及JNK，研究[23]證實(shí)，三者都參與了病毒的傳播與復(fù)制。JNK蛋白磷酸化能介導(dǎo)下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子c-jun與ATF2的活化，從而參與干擾素的形成，并且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[23]。

綜上，甘露消毒丹中的芳香藥物治療流感的作用機(jī)制是一個(gè)多基因、多生物過程、多信號(hào)通路共同參與的過程，本課題預(yù)測(cè)了甘露消毒丹中的芳香藥物治療流感的相關(guān)分子靶點(diǎn)主要通過激活免疫系統(tǒng)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并抑制過度的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抗病毒及減少免疫損傷的治療目的，為深入探討甘露消毒丹治療流感的作用機(jī)制，進(jìn)一步開展有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。