葛無(wú)非，張賢祚，朱 晨

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院，安徽合肥230722）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)已成為關(guān)節(jié)終末期疾病治療的主流手段［1］。然而，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染（periprosthetic joint infection,PJI）是這一手術(shù)面臨的重大挑戰(zhàn)，也給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和患者家庭帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)［2］。PJI的診斷有賴于致病微生物的檢測(cè)和識(shí)別，通常采取關(guān)節(jié)液培養(yǎng)等方法進(jìn)行致病微生物的檢測(cè)。然而，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法的PJI總體檢出率較低，在高達(dá)30%的病例中產(chǎn)生了假陰性結(jié)果［3］。研究發(fā)現(xiàn)，一方面PJI的致病微生物譜與骨骼肌肉常見(jiàn)感染相異，另一方面預(yù)防和治療性的使用抗生素降低了致病微生物的檢出率，但部分微生物仍通過(guò)形成生物膜依附在人工關(guān)節(jié)表面，造成長(zhǎng)期慢性感染，給PJI的診斷和治療造成困難［4，5］。目前，已有研究采用新的技術(shù)手段提高PJI診斷的效能（如高通量測(cè)序、病原微生物芯片等），但致病微生物培養(yǎng)仍然是PJI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)進(jìn)一步的藥物敏感試驗(yàn)仍然是指導(dǎo)后續(xù)抗生素治療必不可少的環(huán)節(jié)［6］。研究顯示，破壞微生物生物膜釋放內(nèi)藏其中的微生物是提高PJI致病微生物檢出率的有效方法?；谇捌诮?jīng)驗(yàn)，本院自2018年以來(lái)對(duì)人工關(guān)節(jié)PJI患者的致病微生物檢測(cè)培養(yǎng)手段進(jìn)行了改進(jìn)。本研究回顧分析了既往送檢標(biāo)本的病例資料，事實(shí)證明這一方法有效提高了致病微生物的檢出效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷為人工髖（膝）關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染；（2）診斷為人工髖（膝）關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)；（3）診斷為人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后疼痛的住院病例；（4）初次手術(shù)和翻修手術(shù)均在本院實(shí)施。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）保留假體清創(chuàng)的病例；（2）合并全身或其他組織感染性病變的病例；（3）不是下述三種方法送檢標(biāo)本培養(yǎng)的病例；（4）標(biāo)本超過(guò)6 h未送檢或有明確污染可能的病例。

1.2 一般資料

2018年12月～2020年1月，共有254例患者因各種原因進(jìn)行了人工髖膝關(guān)節(jié)翻修手術(shù)，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共有231例符合上述標(biāo)準(zhǔn)納入本研究。患者均采用3種方法進(jìn)行了樣本的處理和培養(yǎng)，包括關(guān)節(jié)液、組織勻漿和超聲震蕩液。其中男94例，女137例，平均年齡（63.96±11.08）歲；行髖關(guān)節(jié)翻修154例、膝關(guān)節(jié)77例；158例患者接受了一期翻修治療，73例患者接受了二期翻修治療。根據(jù)MSIS指南，87例確定為PJI患者，144例確定為非感染性原因的翻修。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，所有患者均知情同意。

1.3 標(biāo)本采集與處理

所有標(biāo)本均采自深部組織，采集工作均在術(shù)中完成。所有標(biāo)本均在6 h內(nèi)經(jīng)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

關(guān)節(jié)液：將關(guān)節(jié)液收集在無(wú)菌離心管中，經(jīng)旋渦混勻、沉淀重懸等步驟后，分別接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和羅氏培養(yǎng)基，在35℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)14 d。另取血瓊脂平板接種，置于厭氧袋中，35℃環(huán)境中培養(yǎng)14 d。將0.1 ml液體接種于沙保弱瓊脂平板，35℃環(huán)境中培養(yǎng)7 d。取余液進(jìn)行革蘭氏染色和抗酸染色。如果平板/培養(yǎng)基無(wú)微生物生長(zhǎng)，革蘭氏染色和抗酸染色均無(wú)微生物形態(tài)，則最終結(jié)果記錄為陰性。使用VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃）和VI?TEK-2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃）進(jìn)行細(xì)菌菌種鑒定和抗生素藥敏試驗(yàn)。

組織勻漿：手術(shù)刀切取炎性改變最明顯的假體周圍組織進(jìn)行微生物培養(yǎng)。將組織剪碎，與5顆不銹鋼研磨珠一起放入無(wú)菌研磨管中，并加入1 ml硫乙醇酸鹽肉湯浸沒(méi)標(biāo)本。用組織勻漿機(jī)（武漢塞維爾）以（60±5）kHz頻率勻漿處理120 s（中間間歇10 s）。參照關(guān)節(jié)液培養(yǎng)的方法，將獲得的組織勻漿接種到培養(yǎng)基和平板上并進(jìn)行結(jié)果的判定。微生物鑒定和抗生素藥敏試驗(yàn)方法同前述。

超聲震蕩液：拆除的假體（包括金屬、聚乙烯和骨水泥部件）放置在無(wú)菌、寬口且氣密性良好的容器中，參照 Trampuz［7］和 Rothenberg［8］介紹的方法進(jìn)行超聲震蕩處理。在容器中加入林格液，并進(jìn)行渦旋（渦旋儀GL-88B，?？谄淞重悹枺┘俺曊鹗帲–Q-200B-DST；上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器材廠）。渦旋30 s后立即超聲震蕩。震蕩頻率為（28±2）kHz，持續(xù)10 min。靜置容器1 min，以便氣溶膠沉降，隨后再次渦旋30 s。將處理后的超聲震蕩液用移液器轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中。3 500 r/min離心10 min后棄去試管中上清液，加入生理鹽水定容至10 ml，將試管旋渦混勻，使沉淀重懸。同法再次離心濃縮定容至2 ml，重懸沉淀并接種至培養(yǎng)基或平板上，余液進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色。微生物鑒定和抗生素藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)同關(guān)節(jié)液培養(yǎng)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

采用美國(guó)骨骼肌肉感染學(xué)會(huì)（Musculoskeletal In?fection Society,MSIS）2018年更新的PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)回溯病例再次進(jìn)行診斷，滿足任意主要條件或次要條件評(píng)分≥6分的可以確診感染［9］。采用病原體檢出率作為評(píng)價(jià)培養(yǎng)方法的指標(biāo)，并計(jì)算每種方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。分別計(jì)算使用抗生素組和未使用抗生素組的檢出指標(biāo)，判斷抗生素使用對(duì)不同方法的診斷效能影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非PJI組與PJI組基線特征比較使用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。同一培養(yǎng)方法在抗生素組和非抗生素組對(duì)比及同一組內(nèi)不同方法對(duì)比采用Pearson卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 是否PJI兩組患者的比較

是否PJI兩組患者一般資料與比較見(jiàn)表1。兩組患者在年齡和性別構(gòu)成的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PJI組的膝關(guān)節(jié)比例顯著高于非PJI組（P＜0.05），PJI組一期翻修率顯著低于非PJI組（P＜0.05）。PJI組的術(shù)前抗生素使用率高于非PJI組（P＜0.05）。

表1 兩組患者一般資料與比較

2.2 三種樣本處理方法的檢出效能比較

231例患者中，關(guān)節(jié)液共檢出微生物33例，勻漿和超聲震蕩液分別檢出64例和83例。應(yīng)用MSIS標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PJI進(jìn)行回顧性診斷和判定，本組病例中共有87例PJI患者。三種樣本處理的檢出效能見(jiàn)表2，檢出敏感性由高至低依次為：超聲震蕩液＞組織勻漿＞關(guān)節(jié)液，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但三者間的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 87例PJI患者三種樣本處理檢出效能與比較［%（95%CI）］

2.3 抗生素對(duì)檢出率的影響

87例PJI患者中，47例患者在標(biāo)本采集前的2周內(nèi)使用了抗生素，40例患者未使用抗生素。使用抗生素組的關(guān)節(jié)液和組織勻漿的檢出敏感性較未使用抗生素組顯著降低（P＜0.05），但是否使用抗生素對(duì)超聲震蕩液的檢出敏感性無(wú)顯著影響（P＞0.05）；使用抗生素組的關(guān)節(jié)液、組織勻漿和超聲震蕩液的特異性均較未使用抗生素組顯著降低（P＜0.05）；使用抗生素組的關(guān)節(jié)液和組織勻漿的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較未使用抗生素組顯著降低（P＜0.05），但是否使用抗生素對(duì)超聲震蕩液的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值無(wú)顯著影響（P＞0.05）。使用抗生素組的關(guān)節(jié)液和超聲震蕩液的陰性預(yù)測(cè)值顯著降低（P＜0.05），但是否使用抗生素對(duì)組織勻漿陰性預(yù)測(cè)值無(wú)顯著影響（P＞0.05）。使用抗生素三種培養(yǎng)方法的敏感性由高至低依次為：超聲震蕩液＞組織勻漿＞關(guān)節(jié)液，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；未使用抗生素三種培養(yǎng)方法的敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），是否使用抗生素三種培養(yǎng)方法間的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 細(xì)菌鑒定結(jié)果

本研究所有送檢標(biāo)本共檢出148株微生物，其中檢出量較多的有：金黃色葡萄球菌（57株）、表皮葡萄球菌（44株）、其他凝固酶陰性葡萄球菌（13株）。在使用抗生素和未使用抗生素的病例中，檢出的微生物譜相似：檢出最多的微生物及占比分別為金黃色葡萄球菌（38.36% vs 38.67%，P=0.432）、表皮葡萄球菌（30.14% vs 29.33%，P=0.331）、其他凝固酶陰性葡萄球菌（9.59% vs 8.00%，P=0.141）。三種取材方法培養(yǎng)獲得的主要微生物譜亦未見(jiàn)明顯差別。關(guān)節(jié)液組、勻漿組和超聲組檢出的主要微生物占比依次為：金黃色葡萄球菌（42.86% vs 41.51% vs 34.33%，P=0.094）；表皮葡萄球菌（32.14% vs 30.19% vs 28.36%，P=0.107）；其他凝固酶陰性葡萄球菌（10.71% vs 9.43% vs 7.46%，P=0.078）。相比較于關(guān)節(jié)液組培養(yǎng)較為單一的微生物譜，勻漿組和超聲組檢出少量少見(jiàn)致病微生物和混合微生物感染，如勻漿組和超聲組分別各檢出3例白色念珠菌感染、1例和2例綠膿桿菌感染；超聲組還檢出1例惡臭假單胞菌和3例表皮葡萄球菌+糞腸球菌的混合感染。

表3 使用抗生素對(duì)不同培養(yǎng)方法診斷PJI的影響［%（95%CI）］

3 討論

本研究回顧性分析了本院近年來(lái)進(jìn)行下肢關(guān)節(jié)置換翻修中病原體培養(yǎng)的三種不同方法，發(fā)現(xiàn)組織勻漿法和超聲震蕩法均能夠有效提高PJI致病微生物的檢出能力。在本研究所納入的病例中，有87例患者最終被診斷為PJI，占總病例數(shù)的37.66%，這與文獻(xiàn)所報(bào)道的翻修原因大致符合。

研究發(fā)現(xiàn)，勻漿組和超聲組均能提高感染診斷的敏感性。在特異性上，三種方法均顯示出了較好的特異性?？紤]到術(shù)前使用抗生素的原因，將數(shù)據(jù)進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)在使用抗生素的病例中，關(guān)節(jié)液組、勻漿組的敏感性低于未使用抗生素的病例（25.53% vs 40.00%；53.19% vs 70.01%）；而超聲組的檢驗(yàn)敏感性未見(jiàn)明顯下降（76.60% vs 77.50%），這可能是因?yàn)閼?yīng)用抗生素抑制了微生物生長(zhǎng)，使其進(jìn)入生物膜對(duì)抗外界壓力，導(dǎo)致在關(guān)節(jié)液中較難培養(yǎng)出活體微生物的緣故。因此，在術(shù)前使用抗生素的病例，采取超聲震蕩法更具有優(yōu)勢(shì)。

導(dǎo)致PJI的致病微生物多種多樣，充分了解致病微生物，并相應(yīng)地選擇合適的培養(yǎng)基有助于培養(yǎng)出存在的病原體。本研究中培養(yǎng)出的致病微生物譜與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致［10，11］。作者推薦采用血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和羅氏培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基系統(tǒng)，能夠最大程度確保多種可能潛在的致病微生物獲得生長(zhǎng)。Shen等［12］建議采用Bactec血培養(yǎng)瓶對(duì)關(guān)節(jié)液進(jìn)行培養(yǎng)，可以提高某一種或幾種微生物的培養(yǎng)鑒定敏感性。在本研究中，使用抗生素與否并未顯著影響檢出致病微生物的菌譜。使用組織勻漿法和超聲震蕩法檢出了少量少見(jiàn)微生物種類，超聲震蕩法還檢出了混合感染的樣本。但這一現(xiàn)象需要謹(jǐn)慎解讀，排除標(biāo)本污染等情況的干擾。

本研究仍然具有一定的局限性：（1）本研究為回顧性研究，對(duì)于資料的收集、干預(yù)過(guò)程中的干擾因素控制難以做到完全一致；（2）由于樣本量的限制，一些數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)難以表現(xiàn)出顯著性差異；（3）PJI的致病因素不僅僅限于某種或某幾種微生物，能否應(yīng)用統(tǒng)一的培養(yǎng)方法分離和鑒別所有的感染因素尚無(wú)定論。

隨著新的分子標(biāo)志物和生物靶標(biāo)的出現(xiàn)，以及測(cè)序技術(shù)的興起和普及，PJI的診斷有了新的工具和手段［13］。但無(wú)論如何，有效的培養(yǎng)方法是鑒定PJI和正確地分離致病微生物必不可少的一環(huán)。假體周圍組織勻漿培養(yǎng)和假體超聲震蕩液培養(yǎng)對(duì)于臨床鑒定病原微生物能夠產(chǎn)生有效幫助。包含更多處理?xiàng)l件、綜合各種術(shù)前指標(biāo)的個(gè)性化培養(yǎng)方法具有廣闊的前景，其后續(xù)研究對(duì)臨床工作具有重大意義。