劉 敏,張 弘,程 豐,張茂娜,趙涓涓

(1 湖北省鄂州市中心血站,鄂州 436000;2 鄂州市中心醫(yī)院檢驗科;3 鄂州市中心醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:zhangh2316@sina.com)

乳腺癌是女性群體中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年上升[1]。盡管乳腺癌的診斷和治療手段已有了很大的進步,仍有眾多乳腺癌患者的預后較差[2]。乳腺癌細胞的快速增殖和轉(zhuǎn)移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。尋找新的分子診斷標志物和治療靶點,已成為乳腺癌研究領(lǐng)域的重要方向。在人體各個細胞中存在大量微小RNA(miRNA),其通過靶向結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū),降解靶基因mRNA或抑制其翻譯,負向調(diào)控靶基因的表達[4,5]。miRNA在細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移、衰老、凋亡等生物學行為中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病與進展[6,7]。miR-7156-3p是miRNA家族的重要一員,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中異常低表達,發(fā)揮抑癌基因的作用[8]。目前,關(guān)于miR-7156-3p在乳腺癌中的表達和調(diào)控機制尚不清楚。本研究通過分析miR-7156-3p在乳腺癌患者血清和乳腺癌細胞株中的表達情況,探討miR-7156-3p影響乳腺癌細胞增殖和遷移的調(diào)控機制,以期為乳腺癌的診斷和治療提供新的分子標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 血清樣本

收集2018年8月至2020年7月于鄂州市中心醫(yī)院進行手術(shù)治療的乳腺癌患者術(shù)前血清樣本42例,以2019年2月至2019年10月于鄂州市中心醫(yī)院體檢中心的健康體檢者血清樣本42例作為對照。所有乳腺癌患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物治療。血清儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)存貯。本研究經(jīng)鄂州市中心醫(yī)院倫理委員會審批通過,所有患者及健康體檢者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑

RAB1A野生型質(zhì)粒(RAB1A-WT)、RAB1A突變體質(zhì)粒(RAB1A-MUT)、miR-NC、miR-7156-3p模擬物購自廣州銳博生物科技有限公司;人正常乳腺上皮細胞MCF10A和乳腺癌細胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。qPCR引物由上海生物工程股份有限公司合成。qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司。Transwell小室購自美國Corning公司。GAPDH、RAB1A、E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白抗體購自英國Abcam公司(蛋白編號分別為ab8245、ab36839、ab76055、ab18203、ab53519和ab27568)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF10A和MB-MDA-468細胞,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC1937、MCF7、SKBR3、BT549細胞,在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),胰酶消化并傳代。將對數(shù)生長期的HCC1937細胞平鋪于6孔板,當細胞融合度達30%時,將HCC1937細胞隨機分為miR-NC組和miR-7156-3p組,根據(jù)LipofectamineTM3000試劑說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染,分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-7156-3p模擬物。轉(zhuǎn)染48 h后,進行后續(xù)實驗。

1.4 qPCR檢測血清或細胞中miR-7156-3p和RAB1A mRNA的表達

向待測血清或細胞中加入Trizol裂解液,分別提取總RNA,并進一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20 μl的qPCR反應體系進行擴增檢測。qPCR引物見表1。采用2-ΔΔCt分析計算miR-7156-3p或RAB1A mRNA的相對表達量。miR-7156-3p檢測以U6為內(nèi)參,RAB1A mRNA檢測以GAPDH為內(nèi)參。

表1 qPCR引物序列

1.5 MTT法檢測兩組HCC1937細胞增殖能力

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組HCC1937細胞密度為1.5×104個/ml,以150 μl/孔接種96孔板,每組4個復孔。分別在細胞貼壁1,2,3,4,5 d加入20 μl濃度為5 g/L的MTT試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,棄上清,加入150 μl/孔的二甲基亞砜,振蕩保證晶體溶解,酶標儀檢測兩組HCC1937細胞在490 nm波長處的吸光值。實驗重復4次。

1.6 Transwell小室實驗檢測兩組HCC1937細胞遷移能力

采用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整兩組HCC1937細胞密度為1.8×104個/ml,以200 μl/孔接種于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μl,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室上室,采用棉簽小心擦去未穿過的細胞。加入多聚甲醛進行固定,加入結(jié)晶紫進行染色,采用磷酸鹽緩沖液洗滌并晾干。于倒置顯微鏡下,每組隨機選取4個視野,計數(shù)穿過的細胞數(shù)并取平均值。實驗均重復4次。

1.7 生物信息學預測miR-7156-3p的靶基因

本研究以MicroT-CDS預測網(wǎng)站預測miR-7156-3p可能的靶基因,以O(shè)ncoLnc預后分析網(wǎng)站分析其靶基因表達水平與乳腺癌患者生存期的關(guān)系。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-7156-3p的靶基因

將對數(shù)生長期的HCC1937細胞隨機分為4組,分別共轉(zhuǎn)染RAB1A-WT+miR-NC、RAB1A-WT+miR-7156-3p、RAB1A-MUT+miR-NC和RAB1A-MUT+miR-7156-3p。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書,分析4組細胞的相對熒光酶活性。實驗重復4次。

1.9 Western blotting檢測RAB1A及下游蛋白表達

向兩組HCC1937細胞加入裂解液充分裂解40 min,離心獲得細胞總蛋白。每組上樣50 μg至聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE),110 V恒壓電泳1.5 h。以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜。于5%脫脂牛奶中封閉2 h,加入一抗在冰箱內(nèi)孵育過夜,加入二抗在室溫孵育2 h。均勻滴加增強化學發(fā)光試劑,在凝膠成像系統(tǒng)中顯影并拍照。實驗重復4次。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析,實驗資料均以均數(shù)±標準差表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表達情況

qPCR檢測結(jié)果顯示,乳腺癌患者血清中miR-7156-3p的表達水平為1.48±0.49,低于健康體檢者(8.71±1.69),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖1)。

與健康體檢者相比,* * P <0.01圖1 乳腺癌患者血清miR-7156-3p的表達水平Figure 1 The expression level of miR-7156-3p in the serum of breast cancer patients

2.2 乳腺癌細胞株和人正常乳腺上皮細胞miR-7156-3p表達水平

qPCR檢測結(jié)果顯示,與正常乳腺上皮細胞MCF10A比較,乳腺癌細胞株HCC1937、MCF7、MB-MDA-468、SKBR3、BT549中miR-7156-3p的表達明顯降低(P<0.05),HCC1937細胞中的變化最為明顯(P<0.01,見圖2)。

與MCF10A細胞相比,* P <0.05,* * P <0.01圖2 乳腺癌細胞株和正常乳腺上皮細胞中miR-7156-3p的表達水平Figure 2 The miR-7156-3p expression in breast cancer cell lines and normal breast epithelial cells

2.3 miR-7156-3p轉(zhuǎn)染效率驗證及各組HCC1937細胞中RAB1A mRNA的表達

miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細胞中miR-7156-3p相對表達量分別為1.01±0.07和9.03±1.08,與miR-NC組相比,miR-7156-3p組HCC1937細胞中miR-7156-3p的表達顯著增加(P<0.01)。miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細胞中RAB1A mRNA相對表達量分別為1.01±0.08和0.25±0.05,與miR-NC組相比,miR-7156-3p組HCC1937細胞中RAB1A mRNA的表達明顯降低(P<0.01)。

2.4 過表達miR-7156-3p對HCC1937細胞增殖能力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,從2 d開始,miR-7156-3p組HCC1937細胞的增殖能力顯著下降(P<0.05,見圖3)。

2.5 過表達miR-7156-3p對HCC1937細胞遷移的影響

Transwell小室實驗檢測結(jié)果顯示,miR-NC組和miR-7156-3p組HCC1937細胞的遷移細胞數(shù)分別為147.80±16.30和58.87±12.14。與miR-NC組相比,過表達miR-7156-3p的HCC1937細胞遷移能力明顯下降(P<0.01,見圖4)。

與miR-NC組相比,* P <0.05,* * P <0.01圖3 過表達miR-7156-3p對HCC1937細胞增殖的影響Figure 3 Effect of miR-7156-3p overexpression on proliferation of HCC1937 cells

圖4 Transwell法檢測過表達miR-7156-3p對HCC1937細胞遷移的影響 (結(jié)晶紫染色,×100)Figure 4 Effect of miR-7156-3p overexpression on migration of HCC1937 cells by Transwell (crystal violet staining,×100)

2.6 miR-7156-3p與靶基因結(jié)合位點驗證

MicroT-CDS預測網(wǎng)站顯示,miR-7156-3p可能的靶基因是RAB1A(見圖5)。OncoLnc預后分析網(wǎng)站顯示,RAB1A表達水平較低的乳腺癌患者生存期較長(P<0.05,見圖6)。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示,相比miR-NC,miR-7156-3p可明顯下調(diào)RAB1A-WT質(zhì)粒的報告熒光強度(P<0.01,見圖7);對預測結(jié)合部位行突變處理后,相比miR-NC,miR-7156-3p不能抑制RAB1A-MUT質(zhì)粒的報告熒光強度(P>0.05,見圖7),表明miR-7156-3p的靶基因是RAB1A。

2.7 過表達miR-7156-3p對RAB1A蛋白及下游蛋白表達的影響

圖5 miR-7156-3p與RAB1A-WT和RAB1A-MUT結(jié)合預測圖Figure 5 The predicted map of miR-7156-3p binding to RAB1A-WT and RAB1A-MUT

Western blotting結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-7156-3p后,RAB1A蛋白表達明顯降低,AKT蛋白的磷酸化程度明顯降低,AKT下游蛋白mTOR的表達明顯降低(見圖8)。

圖6 RAB1A表達水平與乳腺癌患者生存期的關(guān)系Figure 6 Relationship between the expression level of RAB1A and the survival time of breast cancer patients

與miR-NC相比,* * P <0.01圖7 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-7156-3p與RAB1A之間的靶向結(jié)合Figure 7 The dual luciferase reporter system verified the targeted binding between miR-7156-3p and RAB1A

與miR-NC組相比,* P <0.05,* * P <0.01圖8 Western blotting檢測miR-7156-3p對RAB1A蛋白及下游蛋白表達的影響Figure 8 Effect of miR-7156-3p on the expression of RAB1A protein and downstream proteins by Western blotting

3 討論

miRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用[9,10]。近年來,越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中異常表達,負責調(diào)控乳腺癌細胞的各種惡性生物學行為[11,12]。Huang等[13]報道,miR-532-5p在乳腺癌組織中高表達,下調(diào)miR-532-5p表達可抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。Maimaitiming等[14]報道,與鄰近癌旁組織相比,乳腺癌組織樣品中miR-152的表達明顯下調(diào);過表達miR-152顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,ROCK1是miR-152在乳腺癌中的靶基因。有報道指出[8],神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miR-7156-3p的表達顯著下調(diào),miR-7156-3p下降水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率密切相關(guān),抑制miR-7156-3p表達可有效刺激神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的轉(zhuǎn)移和生長,增強miR-7156-3p表達可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的轉(zhuǎn)移和生長。本研究篩選出miR-7156-3p低表達最顯著的HCC1937細胞進行實驗,通過轉(zhuǎn)染miR-7156-3p成功上調(diào)miR-7156-3p的表達后,HCC1937細胞的增殖和遷移能力明顯降低,表明miR-7156-3p在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

通過生物信息學方法預測顯示,miR-7156-3p與Ras相關(guān)蛋白Rab-1A(Ras-related protein Rab-1A,RAB1A) mRNA的3′非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點,RAB1A可能是其靶基因。RAB1A蛋白屬于Rab蛋白家族成員,參與調(diào)控細胞內(nèi)的信號通路轉(zhuǎn)導,影響細胞囊泡運輸和膜轉(zhuǎn)運等過程[15,16]。有報道顯示,RAB1A在結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中異常高表達,與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期正相關(guān)[17,18]。RAB1A在乳腺癌組織中高表達,抑制RAB1A表達可降低乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[19]。本研究通過OncoLnc預后分析顯示,RAB1A表達水平較低的乳腺癌患者生存期較長。通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)證實,RAB1A是miR-7156-3p的靶基因。qPCR和Western blotting檢測結(jié)果進一步證實miR-7156-3p可負向調(diào)控RAB1A的表達。RAB1A主要通過促進AKT蛋白的磷酸化發(fā)揮癌基因作用[20]。Western blotting檢測結(jié)果顯示,miR-7156-3p降低RAB1A表達后,AKT蛋白的磷酸化程度明顯降低,其下游蛋白mTOR的表達明顯降低。

綜上所述,miR-7156-3p在乳腺癌患者血清及乳腺癌細胞株中低表達,過表達miR-7156-3p可通過靶向調(diào)控RAB1A基因的表達,降低AKT蛋白的磷酸化,抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。本研究為miR-7156-3p作為乳腺癌診斷和治療的分子標志物和治療靶點提供了一定的實驗基礎(chǔ)。