沈慧穎，呂子豪，莊粟裕，曹秀明，王清清，

(1 江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2 江蘇陽光股份有限公司，江蘇 無錫 214400)

近年來，抗生素在全球范圍的過度使用或?yàn)E用導(dǎo)致了具有多重耐藥性的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)和傳播，預(yù)防病原體感染已成為一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題，發(fā)展新型抗菌策略迫在眉睫[1-2]。光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)就是一種用于預(yù)防微生物感染十分有前景的新型療法，可以用于包括細(xì)菌、病毒以及真菌在內(nèi)的多種微生物的滅活[3]。與傳統(tǒng)抗菌方法相比，該療法具有廣譜抗菌的特點(diǎn)，且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗性，生物毒性低[4]，具有良好的研究前景。PACT法的原理是光敏劑受光激發(fā)后，將能量傳遞給氧分子，使其生成具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)等活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)來使微生物失活，化學(xué)機(jī)理包括Ⅰ型機(jī)制(自由基機(jī)制)和Ⅱ型機(jī)制(單線態(tài)氧機(jī)制)[5-6]。

針對(duì)細(xì)菌耐藥問題，本工作采用靜電紡絲法制備醋酸/原卟啉(CA/PpIX)復(fù)合多孔超細(xì)纖維膜，對(duì)纖維膜的形貌、光敏劑的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及底物氧化性能進(jìn)行了研究，并且評(píng)價(jià)了材料對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的光敏抗菌效果。最后，設(shè)計(jì)3種(KI，NaNO2，MgCl2)無機(jī)鹽溶液濃度梯度實(shí)驗(yàn)，探究不同種類無機(jī)鹽溶液對(duì)CA/PpIX膜光敏抗菌效果的增強(qiáng)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二醋酸纖維素(CDA，MW= 200000，特性黏度Iv=1.45 dL /g)購自南通醋酸纖維有限公司；丙酮，分析純；二氯甲烷(DCM)，分析純；碘化鉀，分析純；氯化鎂，分析純；亞硝酸鈉，分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；原卟啉(PpIX)，純度≥99.99%，優(yōu)級(jí)純；1，3-二苯基異苯并二吡喃(DPBF)，純度> 98%以及重水(D2O)購自上海維塔化學(xué)試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)及大腸桿菌(8099)，購自上海協(xié)久生物科技有限公司。

1.2 靜電紡多孔CA/PpIX復(fù)合纖維的制備

將1.014 g醋片溶于50 mL裝有20 mL DCM/丙酮(體積比為8/2)混合溶液的錐形瓶中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的二醋酸纖維紡絲液，隨后置于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢? h以上以形成均質(zhì)溶液。同時(shí)制備3個(gè)上述紡絲液，待混合溶液攪拌均勻后，取其中兩個(gè)錐形瓶中分別加入質(zhì)量為50.7,101.4 mg的PpIX，避光，接著置于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢?4 h以上至溶質(zhì)完全溶解，另一個(gè)錐形瓶不添加PpIX，從而得到CA為4%，PpIX為CA的0,5%,10%的紡絲液。

將配置的上述3種紡絲液倒入規(guī)格為20 mL且表面包覆錫紙的注射器中，安裝到微量注射泵上，在注射器針頭(外徑0.7 mm)接上高壓電源的正極，用覆有光滑鋁箔紙的滾筒作為接收裝置與負(fù)極相連。在高壓靜電場(chǎng)作用下，紡絲液所受電場(chǎng)力克服溶液表面張力后，噴射出帶電射流，隨著溶劑的揮發(fā)，固化為纖維隨機(jī)排布于收集裝置上[18]。靜電紡絲工藝參數(shù)為：室溫，避光，紡絲電壓19 kV，注射泵控制溶液流速2 mL/h，紡絲接收距離15 cm，滾筒的轉(zhuǎn)速600 r/min。分別紡得CA,CA/PpIX-5,CA/ PpIX-10纖維膜，紡絲結(jié)束后，卸下鋁箔紙，置于65 ℃的真空烘箱中干燥6～12 h備用。

1.3 復(fù)合纖維膜的單線態(tài)氧直接檢測(cè)

使用FL3-111 Horiba穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀檢測(cè)CA/PpIX膜光照條件下產(chǎn)生的單線態(tài)氧(1O2)。將3 cm×3 cm的CA/PpIX膜浸入裝有1.5 mL D2O的10 mL燒杯中，使用D2O的原因在于1O2在D2O (≈67 μs)中的壽命比在H2O (≈3.5 μs)中的更長(zhǎng)，從而使磷光檢測(cè)更容易[11]。隨后，用LED燈(6 W)光照10 min，將溶液轉(zhuǎn)移到0.7 mL的石英比色皿中。最后，以氙燈(450 W)為激發(fā)源進(jìn)行單線態(tài)氧檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，帶通為8 nm，檢測(cè)到1O2的熒光發(fā)射，發(fā)射波長(zhǎng)范圍1100～1400 nm，帶通為20 nm。

1.4 復(fù)合纖維膜的氧化性能

通過底物DPBF/甲醇溶液在光照條件下410 nm處的吸光度變化來判斷復(fù)合纖維膜的氧化能力。將CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中烘燥3 h并用直徑為1.4 cm的壓片機(jī)將其切成圓形。將圓形薄膜分別置于10 mL的裝有5 mL 74 μM DPBF/甲醇溶液的燒杯中，在激光筆(λ=532 nm，40 mW)的照射下，每隔1.5 min用UV-2600型紫外分光光度計(jì)記錄一次溶液的光譜及特征波長(zhǎng)下(410 nm)的吸光度，并與相應(yīng)的暗室樣品進(jìn)行對(duì)照。

1.5 光動(dòng)力抗菌性能評(píng)價(jià)

參考AATCC 100-2012《抗菌紡織品的評(píng)價(jià)方法》對(duì)CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜進(jìn)行抗菌性能評(píng)價(jià)，選取革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌(E.coli)兩種菌作為測(cè)試菌種。

將真空干燥后的纖維膜裁成若干個(gè)大小形狀一致、厚度均一的圓形試樣，并將其分別放入24孔板中。取0.1 mL濃度為1×108～3×108cfu/mL的菌液(PBS緩沖液)滴在24孔板中的樣品上，并將各組樣品分別置于光照(光強(qiáng)為65 mW/cm2，波長(zhǎng)為420～780 nm)及暗室條件中培養(yǎng)30 min后，加入0.9 mL的PBS緩沖液。振蕩均勻后，分別取0．1 mL的原菌液(空白對(duì)照組)以及與試樣上的菌液，加入0.9 mL PBS緩沖液，在3 mL的離心管中依次等梯度稀釋106倍(每個(gè)樣品做3組平行實(shí)驗(yàn))。最后分別從每個(gè)離心管中取10 μL各稀釋梯度的溶液滴在TSA(S.aureus)或LA(E.coli)培養(yǎng)基平板上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后記錄平板各列的菌落數(shù)，以與其等濃度的原菌液(沒有樣品膜的24孔板)為對(duì)照組計(jì)算細(xì)菌存活率與標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)式(1)可以計(jì)算出抑菌率N，對(duì)CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜的抗菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

(1)

式中：No為原菌液可計(jì)數(shù)列的菌落最大值；Ni為試樣抗菌后與原菌液對(duì)應(yīng)梯度下的菌落值。

1.6 KI及無機(jī)鹽促進(jìn)CA/PpIX膜光動(dòng)力抗菌性能評(píng)價(jià)

與上述純纖維膜抗菌步驟操作不同的是，在探究不同濃度梯度的無機(jī)鹽溶液(0，10，25，50，100 mmol/L)對(duì)CA/PpIX-5,CA/PpIX-10膜介導(dǎo)的光動(dòng)力抗菌效果增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需分別在24孔板中的纖維膜上滴加100 μL的無機(jī)鹽溶液(KI或MgCl2或NaNO2)和100 μL含有107～108cfu/mL細(xì)菌的PBS溶液后搖勻，然后在氙燈下(光強(qiáng)為65 mW/cm2，波長(zhǎng)為420～780 nm)光照30 min，同時(shí)對(duì)照組置于暗室30 min。光照結(jié)束后各加入0.8 mL PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，隨后的操作與上述抗菌方法相同。除此之外，僅含有純無機(jī)鹽溶液及加入CA纖維膜無機(jī)鹽溶液的24孔板也需進(jìn)行相同條件的光照以作為光照組對(duì)照組。

1.7 其他表征

用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜的表面形貌；用TCS SP8型激光共聚焦掃描顯微鏡觀察PpIX在靜電紡多孔醋酸纖維上的分布情況(PpIX的熒光激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為632 nm)；用Nicolet IS10型傅里葉變換紅外光譜儀中的衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)對(duì)纖維膜進(jìn)行測(cè)試分析(分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次，波數(shù)范圍為4000～800 cm-1)；用LABRAM HR-800型拉曼光譜儀進(jìn)一步對(duì)PpIX粉末和纖維膜進(jìn)行表征，判斷PpIX的負(fù)載情況(激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，波數(shù)范圍1750～900 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌觀察

圖1是純CA膜、CA/PpIX-5以及CA/PpIX-10多孔醋酸纖維膜的掃描電鏡圖和激光共聚焦掃描顯微鏡圖。

圖1 CA(a)，CA/PpIX-5(b)和CA/PpIX-10(c)纖維膜的SEM圖像與CLSM圖像

從圖1(a-1)，(b-1)，(c-1)來看，負(fù)載原卟啉后的多孔醋酸纖維形貌并沒有發(fā)生顯著的改變。與傳統(tǒng)靜電紡醋酸納米纖維相比(纖維表面光滑、無孔，直徑約為500 nm[19])，多孔醋酸纖維的直徑更粗，為微米級(jí)(通過粒徑分布計(jì)算軟件測(cè)得平均直徑在2～3 μm)。這可能是由二氯甲烷快速揮發(fā)使得射流快速凝固，纖維未能得到足夠的牽伸而導(dǎo)致的[19]。從圖1的SEM照片中可以發(fā)現(xiàn)，纖維大多為多孔柱狀，含有少量的扁平帶狀，這是因?yàn)樯淞髟诶旃袒瘯r(shí)，溶劑的快速揮發(fā)使得射流表層先形成多孔結(jié)構(gòu)，而射流內(nèi)層的溶液形成濃度梯度差，同時(shí)表面溶劑的揮發(fā)速率遠(yuǎn)大于內(nèi)層溶劑的擴(kuò)散速率，從而在大氣壓作用下坍塌形成扁平帶狀結(jié)構(gòu)[20]。此外，沿纖維軸向分布的孔洞清晰可見且分布較為均勻，多為細(xì)長(zhǎng)橢圓形，其大小深淺不一?？锥吹男纬墒怯捎贒CM(沸點(diǎn)39.8 ℃)的高揮發(fā)性，其在靜電紡絲過程中快速揮發(fā)，使得射流表面溫度急劇降低，引發(fā)熱致相分離，形成富溶質(zhì)相和富溶劑相；此外溫度的下降使周圍環(huán)境中的水蒸氣液化為小水珠聚集在射流表面，CA和PpIX均不溶于水，聚合物在水珠周圍凝固。在兩者的共同作用下，富溶質(zhì)相處形成纖維骨架，富溶劑相和水珠在紡絲過程中快速揮發(fā)，在纖維表面形成凹凸不平、大小不一的孔洞[19]。表面多孔的CA/PpIX纖維膜對(duì)細(xì)菌有良好的吸附效果，可使活性氧物種與細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)有效接觸，從而更好地發(fā)揮抗菌效果。

從圖1(a-3)可以觀察到，未添加原卟啉的純CA膜沒有表現(xiàn)出任何熒光效應(yīng)。而CA/PpIX-5和CA/PpIX-10纖維膜則發(fā)出均勻的紅光，圖1(b-3)，(c-3)，表明PpIX均勻地分布在多孔醋酸纖維表面上，并未完全包埋在纖維內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)了良好的表面負(fù)載。雖然光敏劑含量CA/PpIX-5比CA/PpIX-10少50%，但從熒光效應(yīng)圖上發(fā)現(xiàn)兩者的表面負(fù)載量相差不大?？赡苁且?yàn)樯淞鞅韺尤軇]發(fā)的同時(shí)使得表層溶液的濃度隨之升高，而PpIX在濃度較高時(shí)極易發(fā)生聚集現(xiàn)象[21]，因此在射流表面發(fā)生了一定程度的聚集，而光可能無法穿透某些聚集體的內(nèi)部，故只有表層的PpIX在激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)出熒光。

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2為純CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜的紅外光譜圖以及共振拉曼光譜。

圖2 CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜的ATR-FTIR光譜(a)和拉曼光譜(b)Fig.2 ATR-FTIR spectra (a) and Raman spectra (b) of CA, CA/PpIX-5 and CA/PpIX-10 fibrous membranes

2.3 單線態(tài)氧的直接檢測(cè)及底物氧化

圖3是CA,CA/PpIX膜的瞬態(tài)熒光光譜及DPBF溶液紫外吸收光譜。原卟啉PpIX經(jīng)光照后可產(chǎn)生在單線態(tài)氧(1O2)，當(dāng)1O2回到基態(tài)時(shí)，可輻射能量發(fā)光。利用瞬態(tài)光譜技術(shù)可以觀察到單線態(tài)氧在1270 nm發(fā)光[6]。圖3(a)是CA及CA/PpIX膜的瞬態(tài)熒光光譜，1270 nm處出現(xiàn)特征峰證明CA/PpIX在光照條件下確實(shí)產(chǎn)生了1O2[24]。

DPBF是一種熒光分子，對(duì)單線態(tài)氧(1O2)具有高度特異性反應(yīng)，它可以與1O2發(fā)生Diels-Alder型加成反應(yīng)生成內(nèi)過氧化物，將其氧化成二苯甲?；?BPO)[25]，使DPBF熒光強(qiáng)度降低。圖3(b)是CA/PpIX-10纖維膜在持續(xù)光照條件下，溶液紫外吸收變化的光譜圖。在1O2的氧化作用下，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光色的DPBF逐漸被氧化成無色的BPO，溶液顏色逐漸變淺，在410 nm處的吸光度隨之下降。圖3(c)，(d)是純CA膜、CA/PpIX-5以及CA/PpIX-10纖維膜410 nm處吸光度隨時(shí)間的變化圖。經(jīng)激光照射后，純CA膜和DPBF沒有發(fā)生氧化反應(yīng)，溶液410 nm處的吸光度幾乎沒有變化，而CA/PpIX-5及CA/PpIX-10纖維膜的吸光度顯著下降，且隨時(shí)間成線性變化，說明其具有良好的光動(dòng)力氧化性能。然而，盡管CA/PpIX-10負(fù)載了更多的光敏劑，但其光敏活性在一定程度上受到PpIX團(tuán)聚的影響，故其有效負(fù)載量較低[21]，單線態(tài)氧產(chǎn)率較CA/PpIX-5稍低。另外，如圖3(d)所示，正如預(yù)期，對(duì)照組的DPBF均未被氧化，溶液410 nm處的吸光度基本沒有發(fā)生變化。

圖3 CA，CA/PpIX纖維膜的瞬態(tài)熒光光譜(a)、CA/PpIX-10膜的DPBF溶液紫外吸收光譜(b)和410 nm處不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CA/PpIX膜的DPBF溶液紫外吸收曲線(c)以及對(duì)照組(d)的DPBF溶液紫外吸收曲線Fig.3 Transient state fluorescence spectrum (a), UV-Vis absorption spectra of KI solution photooxidized by CA/PpIX-10 (b),UV-Vis absorbance of DPBF solution at 410 nm photooxidized by different proportions of CA/PpIX membranes (c) and control group (d)

2.4 抗菌及無機(jī)鹽增強(qiáng)抗菌實(shí)驗(yàn)

圖4為CA膜、CA/PpIX膜及膜添加無機(jī)鹽后對(duì)金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌(E.coli)的抗菌效果圖。

圖4 CA，CA/PpIX-5和CA/PpIX-10膜對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抗菌效果圖(a)、膜在KI溶液作用下的抗菌效果圖(b)及CA/PpIX-5膜在3種無機(jī)鹽作用下對(duì)金黃色葡萄球菌(c)和大腸桿菌(d)的抗菌效果圖Fig.4 Antibacterial effect of CA/PpIX-5 and CA/PpIX-10 against S.aureus and E.coli. (a),under the influence of KI solution (b),under the action of three inorganic salts against S. aureus(c) and E.coli(d)

1O2+ I-+ H+→IOOH +I-→

(2)

(3)

通過對(duì)比3種無機(jī)鹽溶液對(duì)CA/PpIX-5膜介導(dǎo)的光動(dòng)力抗菌的增強(qiáng)作用發(fā)現(xiàn)，如圖4(c)，(d)所示，鹵化物對(duì)光動(dòng)力效應(yīng)的增強(qiáng)效果要強(qiáng)于亞硝酸鹽。其原因可能在于光敏劑激發(fā)機(jī)理與無機(jī)鹽的氧化機(jī)理之間的關(guān)系。研究表明，由原卟啉介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用主要是1O2引起光損傷的結(jié)果(Ⅱ型機(jī)制)[21]，而NaNO2的氧化機(jī)理主要?dú)w因于Ⅰ型機(jī)制產(chǎn)生的超氧化物與二氧化氮反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽[29]；鹵化物陰離子的氧化機(jī)理在于與Ⅱ型光化學(xué)過程中的1O2反應(yīng)，繼而產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。

3 結(jié)論

(1)通過靜電紡絲法成功制備了負(fù)載原卟啉PpIX的多孔醋酸超細(xì)纖維，光敏劑PpIX均勻分布在纖維表面，且復(fù)合CA/PpIX纖維實(shí)現(xiàn)了表面造孔，纖維直徑為微米級(jí)，沿纖維軸向分布著大小深淺不一的微米級(jí)孔洞，具有良好的表面形貌及纖維結(jié)構(gòu)。

(2)含PpIX的多孔醋酸纖維膜在光照條件下可產(chǎn)生1O2，具有光動(dòng)力氧化性能，能夠介導(dǎo)革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌的光動(dòng)力失活。由于PpIX為中性光敏劑且在濃度高時(shí)易發(fā)生聚集現(xiàn)象，故CA/PpIX-5的單線態(tài)氧產(chǎn)率高于CA/PpIX-10，且CA/PpIX纖維膜抗金黃色葡萄球菌的效果整體上明顯優(yōu)于抗大腸桿菌。

(3)KI,MgCl2,NaNO2溶液對(duì)CA/PpIX介導(dǎo)的光動(dòng)力抗菌均具有一定的增強(qiáng)作用，其中KI溶液的增強(qiáng)作用最明顯，100 mmol/L的KI溶液可將復(fù)合纖維膜對(duì)兩種模式菌的抗菌效率均提升至99.9999%，其機(jī)理涉及分子碘的原位光生，將來可能會(huì)廣泛應(yīng)用于臨床治療。