李昂，仵紅嬌，謝俞寧，賈禎賢，李佳瑩，張雪梅*

1華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山 063210；2華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山 063210

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大常見(jiàn)癌癥，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第二大原因[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，直腸癌在CRC中占比達(dá)35%。作為先天免疫的重要組成部分，炎癥是癌癥發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)志性特征[2]。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是特殊的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表面相關(guān)分子的表達(dá)而激活免疫應(yīng)答途徑，還可與相應(yīng)配體結(jié)合激活炎癥通路[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，除環(huán)境危險(xiǎn)因素(包括肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、不良飲食、飲酒和吸煙)外，1/3的直腸癌是由遺傳因素誘導(dǎo)發(fā)生的[4-5]，而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)在人類的可遺傳變異中較為常見(jiàn)。調(diào)節(jié)區(qū)和3'非翻譯區(qū)SNP可分別通過(guò)調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的結(jié)合，從而對(duì)靶基因調(diào)控產(chǎn)生影響[6]。因此，具有潛在功能的SNP可能會(huì)增加機(jī)體對(duì)癌癥的易感性。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3調(diào)控區(qū)基因多態(tài)性與腸道病毒71型(EV71)重癥感染的易感性相關(guān)[7]，而腸道感染也是CRC的誘因之一[8]。鑒于TLRs在腫瘤中的重要作用，本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)并利用生物信息學(xué)方法篩選出5個(gè)潛在的功能SNP位點(diǎn)，探討其對(duì)CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，以期為CRC的防治及早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究采用病例對(duì)照的研究策略。選取2008－2016年在華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院和華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院住院治療的480例經(jīng)組織病理學(xué)確診且采血前未接受放化療的原發(fā)性直腸癌患者設(shè)為病例組，另隨機(jī)選取同期在唐山地區(qū)進(jìn)行體檢的480名健康者設(shè)為對(duì)照組，排除與病例組有血緣關(guān)系、有腫瘤家族史、接受放射治療或者抗癌化學(xué)藥物治療的個(gè)體。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(2019021)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 SNP篩選 從dbSNP及Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中提取TLR家族成員基因多態(tài)數(shù)據(jù)信息，篩選位于啟動(dòng)子區(qū)及3'非翻譯區(qū)且在中國(guó)漢族人群中最小等位基因頻率＞0.05的遺傳變異。使用TRANSFAC和SNPinfo Web Serve軟件分別對(duì)篩選出的SNP進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和miRNA結(jié)合能力預(yù)測(cè)，最終確定研究位于啟動(dòng)子區(qū)的TLR3 rs5743303、TLR4 rs1927914、TLR5 rs1640816，以及3'非翻譯區(qū)的TLR4 rs7869402、TLR7 rs3853839多態(tài)。

1.3 基因分型 使用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA。針對(duì)TLR3 rs5743303、TLR5 rs1640816和TLR7 rs3853839多態(tài)，使用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體系包括1×Taq PCR MasterMix Ⅱ(美國(guó)ABI公司)2 μl、探針0.065 μl和基因組DNA 1 μl(＞10 ng)，最后用雙蒸水補(bǔ)至5 μl，使用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR system進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)TLR4 rs1927914和rs7869402多態(tài)，使用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)進(jìn)行基因分型。引物序列如下：TLR4 rs1927914上游5'-TAGCATGAGA AATGAGGAAGTAAGGG-3'，下游5'-GAGCTATG ATGAGGATTGAAAATGTGG-3'；TLR4 rs7869402

上游5'TGGGATCCCTCCCCTGTAGC-3'，下游5'-AGGAGCATTGCCCAACAGG-3'。PCR反應(yīng)體系包括上下游引物各0.1 μl(10 mmol/L)，cDNA 1 μl(＞10 ng)，2×Taq PCR Starmix 3 μl(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)，最后用雙蒸水補(bǔ)至6 μl。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。使用AluⅠ和NsiⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(NEB公司)對(duì)TLR4 rs1927914和rs7869402的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型判斷。為提高基因分型的準(zhǔn)確度，隨機(jī)選取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用GEPIA在線數(shù)據(jù)平臺(tái)分析直腸癌中TLRs的表達(dá)及其與直腸癌預(yù)后的相關(guān)性，ESTIMATE算法分析TLR3表達(dá)與免疫細(xì)胞評(píng)分的相關(guān)性，TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估直腸癌TLR3表達(dá)及拷貝數(shù)變異與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取直腸癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，利用WilcoxTest函數(shù)評(píng)估TLRs基因表達(dá)與病理分期的關(guān)系，KEGG通路和GO功能富集分析TLR3相關(guān)差異基因的表達(dá)[利用R語(yǔ)言中的基因集變異分析(GSVA)軟件包完成]。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較病例組與對(duì)照組研究對(duì)象的基本特征及基因型分布的差異，非條件logistic回歸分析TLRs遺傳變異與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TLRs與直腸癌臨床病理的關(guān)系 GEPIA在線數(shù)據(jù)平臺(tái)分析結(jié)果顯示，TLR3在直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織(P＜0.05)，且其低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)(HR=0.26，95%CI 0.094～0.87，P=0.021)。TLR4、TLR5和TLR7在直腸癌組織與正常組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與直腸癌預(yù)后無(wú)關(guān)(P＞0.05)。TLRs的表達(dá)與直腸癌臨床病理分期無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)(圖1)。

2.2 TLRs遺傳變異與直腸癌易感性的關(guān)系 兩組年齡中位數(shù)均為60歲，年齡、性別以及吸煙和飲酒占比等基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

TLRs遺傳變異各基因型分布與直腸癌易感性的關(guān)系如表2所示。病例組TLR3 rs5743303 AA、AT和TT基因型頻率分別為69.8%(335/480)、26.7%(128/480)和3.5%(17/480)，對(duì)照組分別為76.7%(368/480)、20.8%(100/480)和2.5%(12/480)。非條件l o g i s t i c 回歸分析結(jié)果顯示，與T L R 3 rs5743303 AA基因型相比，AT或TT基因型攜帶者的直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(OR=1.43，95%CI 1.07～1.90)。而TLR4 rs1927914、TLR4 rs7869402、TLR5 rs1640816和TLR7 rs3853839遺傳變異并不影響直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P＞0.05)。

表1 病例組與對(duì)照組基本資料比較[例(%)]Tab.1 Comparison of basic data between patients and controls[n(%)]

表2 Toll樣受體遺傳變異與直腸癌易感性的關(guān)系[例(%)]Tab.2 Relations of TLR genetic variation to the susceptibility of rectal cancer [n(%)]

圖1 TLRs在直腸癌中的表達(dá)及其與病理分期和預(yù)后的相關(guān)性分析Fig.1 Expression of TLRs in rectal cancer tissues and its correlation with the pathological stage and prognosis of rectal cancer

TLR3 rs5743303遺傳變異與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析結(jié)果如表3所示。性別分層結(jié)果顯示，男性AT或TT基因型攜帶者的直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型攜帶者的1.47倍(P=0.041)，在女性中未見(jiàn)該變異影響直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.202)。年齡分層結(jié)果顯示，低年齡(≤60歲)AT或TT基因型攜帶者發(fā)生直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)較高(OR=1.64，95% CI 1.08～2.47，P=0.019)，而在高齡(＞60歲)者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185)。吸煙和飲酒分層結(jié)果顯示，與AA基因型攜帶者相比，攜帶AT或TT基因型的吸煙者(OR=2.42，95% CI 1.37～4.38)和飲酒者(OR=2.70，95% CI 1.52～4.80)發(fā)生直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)較高(P=0.002，P=0.001)。

2.3 TLR3與免疫特征參數(shù)的關(guān)系 ESTIMATE算法分析結(jié)果顯示，TLR3表達(dá)與直腸癌免疫評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.23，P=0.038，圖2A)。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，TLR3表達(dá)與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性最強(qiáng)(r=0.537，P＜0.001)，與巨噬細(xì)胞無(wú)相關(guān)性(r=0.008，P=0.921，圖2C)；體細(xì)胞TLR3拷貝數(shù)變異與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)性(P＜0.05，圖2B)。

表3 TLR3 rs5743303基因分型與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析Tab.3 Stratified analysis of TLR3 rs5743303 genotypes with the risk of rectal cancer

圖2 TLR3與免疫特性參數(shù)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between TLR3 and immune characteristic parameters

2.4 直腸癌中TLR3的GO功能和GSVA富集分析對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中直腸癌的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果顯示，TLR3高表達(dá)主要與受體配體活性、抗原結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等相關(guān)基因功能的改變有關(guān)(圖3A)。GSVA富集分析結(jié)果顯示，TLR3相關(guān)通路主要富集在細(xì)胞凋亡、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、磷脂代謝及自噬調(diào)節(jié)等與代謝或免疫相關(guān)的途徑(圖3B)。

3 討 論

直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，國(guó)人直腸癌發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢(shì)[9]。盡管手術(shù)、靶向治療及放化療已在直腸癌的治療中取得了滿意的療效，但患者5年總體生存率仍較低[10]。因此，對(duì)直腸癌發(fā)病及預(yù)后的影響因素進(jìn)行探索，以發(fā)現(xiàn)直腸癌易感因素及預(yù)后因素，有助于改善直腸癌患者的生存質(zhì)量及預(yù)后情況。

圖3 TLR3表達(dá)對(duì)基因功能和信號(hào)通路的影響Fig.3 Effect of TLR3 expression on gene function and signal pathway

TLR s是特殊的模式識(shí)別受體，可通過(guò)參與不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMP)引起促炎因子、趨化因子和干擾素的釋放而激活炎癥通路，進(jìn)而啟動(dòng)免疫反應(yīng)[11]。TLRs可增加血管通透性，也可通過(guò)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[12]。在免疫治療時(shí)代，腫瘤的發(fā)展受其內(nèi)在特征及外在腫瘤微環(huán)境的共同影響。TLRs活化后經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子并激活樹(shù)突細(xì)胞[13]，而位于腫瘤微環(huán)境中的樹(shù)突細(xì)胞可發(fā)揮抗原提呈作用，使自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞活化，從而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。

Bonnin等[15]發(fā)現(xiàn)，TLR3 mRNA及蛋白在肝癌組織中的表達(dá)均低于癌旁組織，且TLR3表達(dá)下調(diào)與肝癌患者生存率降低有關(guān)。對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤實(shí)質(zhì)中TLR3高表達(dá)與預(yù)后良好相關(guān)[16-17]，在非小細(xì)胞肺癌早期，TLR3高表達(dá)具有抑癌作用且與較高的總體生存率明顯相關(guān)[18]。TLR3激動(dòng)劑是一種強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)劑，可通過(guò)激活TLR3的表達(dá)來(lái)刺激抗原呈遞細(xì)胞，從而活化腫瘤特異性T細(xì)胞，以及將骨髓抑制細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的表型從免疫抑制轉(zhuǎn)為免疫支持[19-21]。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，先天免疫基因TLR3在直腸癌中低表達(dá)且與預(yù)后不良有關(guān)。腫瘤基因表達(dá)譜可以量化腫瘤微環(huán)境中的免疫活性[22]。本研究通過(guò)ESTIMATE和TIMER分析發(fā)現(xiàn)，TLR3與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)具有一定的相關(guān)性，且GSVA富集分析結(jié)果也顯示TLR3低表達(dá)可抑制自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。

TLRs基因中存在的SNP可能會(huì)損害其功能并破壞促炎與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡，增加慢性炎癥和癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[23-25]。TLR3 SNP影響癌癥易感性，可作為評(píng)估癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物[26]。與野生型相比，TLR3突變型與口腔癌和鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)[27]。雖有研究表明TLR3基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，但TLR3的表達(dá)與乳腺癌的侵襲性有關(guān)[28]。迄今為止，關(guān)于TLR3 SNP與直腸癌易感性關(guān)系的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，TLR3低表達(dá)是直腸癌的危險(xiǎn)因素，且TLR3 rs5743303的遺傳變異與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加明顯相關(guān)，但直腸癌中TLR3 rs5743303遺傳變異是否導(dǎo)致基因差異表達(dá)，尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

既往研究發(fā)現(xiàn)，SNP可能通過(guò)破壞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而增加慢性炎癥和癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[29]，但尚未發(fā)現(xiàn)TLR4 rs1927914遺傳變異與肺癌[30]、前列腺癌[31]、肝細(xì)胞癌[32]和胃癌[33]之間有任何明顯關(guān)聯(lián)。本研究亦未發(fā)現(xiàn)TLR4 rs1927914遺傳變異與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。據(jù)報(bào)道，TLR5在多種癌癥中表達(dá)并在癌變中起作用[34-36]。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)，TLR5遺傳變異與人類乳腺癌易感性存在密切關(guān)系。與其他TLR家族成員不同，TLR5在腸道上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并在宿主抵抗腸道細(xì)菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[38]。本研究結(jié)果顯示，TLR5 rs1640816遺傳變異與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者與對(duì)照組TLR7 rs3853839等位基因頻率無(wú)明顯差異[39]。本研究亦未發(fā)現(xiàn)TLR7 rs3853839 G＞C多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有任何關(guān)聯(lián)。

除遺傳因素外，腫瘤的發(fā)生也與環(huán)境因素有關(guān)。流行病學(xué)研究表明，吸煙可能誘發(fā)表觀遺傳改變[40-41]，是直腸癌發(fā)病的適度危險(xiǎn)因素[42-43]。本研究結(jié)果顯示，至少攜帶一個(gè)TLR3 rs5743303 T等位基因的男性和低年齡者具有較高的直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且吸煙、飲酒可增加個(gè)體罹患直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，提示直腸癌的發(fā)生主要是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，TLR3低表達(dá)可能通過(guò)抑制免疫細(xì)胞活性及免疫相關(guān)途徑促進(jìn)直腸癌的發(fā)生與不良預(yù)后，且TLR3遺傳變異可能增加個(gè)體罹患直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。