徐士雪，楊陽，何楊蘭，祁興順

1北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110840；2中國醫(yī)科大學(xué)研究生院，沈陽 110013；3西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710069

C型凝集素樣受體-2(C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2)是細(xì)胞表面受體C型凝集素超家族的一員[1]，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于胞質(zhì)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，每個(gè)ITAM包含2個(gè)保守的YXXL基序，但CLEC-2只擁有1個(gè)YXXL基序，故2個(gè)磷酸化的受體之間通過脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, syk)中串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行橋接形成二聚體，1個(gè)syk通過結(jié)合2分子磷酸化的YXXL進(jìn)行酪氨酸磷酸化。syk激活后，其下游含有SH2結(jié)構(gòu)域的76 ku的白細(xì)胞蛋白(SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 ku，SLP-76)及磷脂酶γ2(PLCγ2)被激活，使鈣離子濃度增加，血小板活化[2](圖1)。在人體內(nèi)該過程高度依賴于血小板衍生的二磷酸腺苷(ADP)及血栓烷A2(TXA2)施加的正反饋[3]。CLEC-2在血小板及巨核細(xì)胞中高表達(dá)，在肝Kupffer細(xì)胞中低表達(dá)。平足蛋白(podoplanin，PDPN)是其目前已知的唯一內(nèi)源性配體，但在血管內(nèi)皮細(xì)胞中并不表達(dá)[2]。

血栓形成是人體內(nèi)的重要保護(hù)機(jī)制，當(dāng)血管或組織損傷時(shí)，血栓形成可以避免機(jī)體過度失血，但同時(shí)它也是缺血性心臟病、缺血性腦卒中及靜脈血栓栓塞等血栓栓塞性疾病的病理基礎(chǔ)。早期研究發(fā)現(xiàn)，CLEC-2特異性缺失的小鼠均有血栓形成障礙表現(xiàn)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CLEC-2可介導(dǎo)血小板活化及聚集[4]；另一方面，表達(dá)于巨核細(xì)胞的CLEC-2介導(dǎo)了血小板生成素的產(chǎn)生，并可通過促進(jìn)PDPN分泌趨化因子5(CCL5)而導(dǎo)致巨核細(xì)胞前血小板化[5]。以上研究結(jié)果表明，CLEC-2表達(dá)與血栓穩(wěn)定及聚集有密切關(guān)系。本文從動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥血栓狀態(tài)、血管壁完整性、癌癥相關(guān)血栓等4個(gè)方面對(duì)CLEC-2在血栓形成過程中的作用進(jìn)行綜述。

圖1 CLEC-2介導(dǎo)血小板活化的示意圖Fig.1 Schematic diagram of CLEC-2 mediated platelet activation

1 CLEC-2與動(dòng)脈粥樣硬化

在血流剪切力作用下，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致的血小板聚集是動(dòng)脈血栓的最常見原因。晚期動(dòng)脈粥樣硬化患者的斑塊破裂后，表達(dá)在斑塊內(nèi)部的PDPN得以暴露，與血小板表面的CLEC-2結(jié)合，促進(jìn)了血小板活化，進(jìn)而加速了動(dòng)脈血栓的形成[6]。Inoue等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在斑塊未破裂時(shí)，仍有配體與CLEC-2相互作用促進(jìn)血栓形成，并通過蛋白芯片等技術(shù)證實(shí)S100鈣結(jié)合蛋白A13(S100A13)在粥樣硬化早期或某些病理狀況下表達(dá)于平滑肌細(xì)胞的管腔面，通過CLEC-2激活血小板，從而促進(jìn)血栓形成；此外，行使CLEC-2細(xì)胞外域功能的重組CLEC-2還可與正常動(dòng)脈壁的平滑肌細(xì)胞結(jié)合，而正常動(dòng)脈壁并不表達(dá)PDPN，也不表達(dá)S100A13，因此正常血管壁上仍可能存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的CLEC-2配體。Furukoji等[8]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)可誘導(dǎo)PDPN在動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)，平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均可表達(dá)VEGF-A，誘導(dǎo)PDPN的過度表達(dá)并激活CLEC-2，導(dǎo)致血栓形成。這為CLEC-2在動(dòng)脈粥樣硬化中介導(dǎo)血栓形成的作用機(jī)制提供了一種新解釋。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂時(shí)，膠原蛋白也得以暴露，作為最有效的血小板活化物質(zhì)，膠原蛋白對(duì)血小板活化的影響較CLEC-2更強(qiáng)烈[9]。以上結(jié)果提示CLEC-2在動(dòng)脈粥樣硬化晚期血栓形成中的作用可能有限。

近年來，越來越多的研究證實(shí)了CLEC-2在心腦血管疾病中的臨床意義。血漿CLEC-2水平增高與冠狀動(dòng)脈疾病[10]及急性缺血性腦卒中[11]發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)。血漿CLEC-2水平增高與卒中加重[優(yōu)勢(shì)比(OR)=1.97，95%置信區(qū)間(CI)=1.11～3.50，P=0.021]及預(yù)后不良(OR=1.70，95%CI=1.17～2.48，P=0.006)顯著相關(guān)[11]。一項(xiàng)納入352例急性缺血性腦卒中患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，在一年隨訪期間，經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的血漿CLEC-2水平每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加4.27倍，死亡/心腦血管事件的合并風(fēng)險(xiǎn)增加2.42倍[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PDPN與CLEC-2在缺血/再灌注損傷的神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而PDPN抗體預(yù)處理可明顯減輕神經(jīng)功能損傷并減少梗死面積，提示CLEC-2與PDPN通過參與缺血性腦卒中誘導(dǎo)腦損傷，進(jìn)而導(dǎo)致預(yù)后不良[13]。

2 CLEC-2與炎癥血栓狀態(tài)

血流淤滯及缺氧是靜脈血栓形成的始動(dòng)因素，而血流畸變可導(dǎo)致缺氧，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的Weibel-Palade小體釋放血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，導(dǎo)致血小板及中性粒細(xì)胞黏附，從而引起血栓及炎癥[14]。Payne等[15]建立了模擬靜脈瓣膜內(nèi)血流畸變的下腔靜脈模型，48h后，誘導(dǎo)CLEC-2缺失的小鼠均未發(fā)生深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)，而未誘導(dǎo)CLEC-2缺失小鼠的DVT發(fā)生率高達(dá)60%；CLEC-2基因敲除小鼠的DVT發(fā)生率也顯著低于CLEC-2基因未敲除的健康小鼠(38% vs. 81%)，向血小板基因缺陷小鼠輸注野生型小鼠的血小板后，血栓形成有所減少，充分證實(shí)了CLEC-2(尤其是血小板CLEC-2)在DVT形成中的重要作用；CLEC-2缺失小鼠的血管壁血小板聚集水平較野生型小鼠低(1.3%±0.4% vs. 7.8%±0.7%，P＜0.003)，而PDPN特異性缺失小鼠的血管壁血小板聚集水平也較野生型小鼠低(2.6%±0.4% vs.6.5%±1.3%，P＜0.03)，表明CLEC-2及PDPN表達(dá)可能是靜脈血栓中血小板募集的必要條件。但在生理狀態(tài)下，PDPN并不在靜脈壁表達(dá)。

在DVT形成過程中，缺氧導(dǎo)致血壓升高及血管壁拉伸，使得內(nèi)皮細(xì)胞間的連接存在縫隙，從而允許血小板滲透到內(nèi)皮下的空間，因此血小板表面的CLEC-2有機(jī)會(huì)與PDPN相互作用[15]。有研究在傷寒沙門菌感染小鼠肝臟模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的促血栓形成機(jī)制：在感染后的小鼠肝臟中，多種巨噬細(xì)胞的PDPN表達(dá)上調(diào)，且血管內(nèi)皮連續(xù)性中斷的區(qū)域可見血小板向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)形成小突起，其機(jī)制可能是內(nèi)皮損傷暴露了表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞中的PDPN，從而促進(jìn)了CLEC-2依賴的血小板活化[16]。炎癥狀態(tài)導(dǎo)致PDPN上調(diào)的機(jī)制仍未明確，需進(jìn)一步研究。

3 CLEC-2與血管壁完整性

血管壁完整性受損會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)暴露，引起血小板活化并聚集，這一過程可能導(dǎo)致血栓形成[9]。因此，維持血管壁完整性也是避免血栓形成的一個(gè)方法。血小板維持血管壁完整性主要是通過ITAM通路進(jìn)行的，參與這一過程的受體只有糖蛋白(GP)Ⅵ及CLEC-2[17-19]。Boulaftali等[20]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了ITAM信號(hào)通路選擇性缺失的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)GPⅥ或CLEC-2缺失均在一定程度上減輕了免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的皮膚炎癥，以及脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥中血小板維持血管完整性的能力；GPⅥ與CLEC-2同時(shí)缺失的小鼠及ITAM基序下游銜接蛋白SLP-76缺失的小鼠均表現(xiàn)為血小板維持血管完整性功能的完全喪失。作為CLEC-2唯一的內(nèi)源性配體，PDPN并不表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞或周細(xì)胞。因此，在脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥中，血小板CLEC-2可能與肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞中高表達(dá)的PDPN相互作用；在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的皮膚炎癥中，PDPN可能通過浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞“傳遞”到炎癥部位，與血小板CLEC-2相互作用，也可能這些組織或血管壁中存在尚未被發(fā)現(xiàn)的CLEC-2配體[20]。表達(dá)于高內(nèi)皮微靜脈(high endothelial venule，HEV)周圍成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞的PDPN與血小板CLEC-2相互作用對(duì)維持HEV的完整性至關(guān)重要[21]。HEV是淋巴組織中特殊的毛細(xì)血管后微靜脈，是淋巴細(xì)胞自血液進(jìn)入淋巴組織的通道。雖然PDPN在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但并不在包括HEV在內(nèi)的血管內(nèi)皮中表達(dá)，缺乏CLEC-2或PDPN的小鼠均表現(xiàn)為自發(fā)性血管滲血[22]。以上研究證實(shí)了血小板CLEC-2的表達(dá)對(duì)維持血管完整性的重要作用，其機(jī)制可能與PDPN有關(guān)，也可能與尚未被發(fā)現(xiàn)的CLEC-2內(nèi)源性配體有關(guān)。

4 CLEC-2與癌癥相關(guān)血栓

血小板可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)或釋放生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤血管生成，惡性腫瘤也可導(dǎo)致血小板活化，致使機(jī)體呈高凝狀態(tài)[23]。生理狀態(tài)下，由于剪切應(yīng)力及免疫細(xì)胞的活動(dòng)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不能在血流中存活。然而，由于多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)PDPN，血小板通過CLEC-2與PDPN結(jié)合包裹在腫瘤細(xì)胞表面，不僅可幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，還可使腫瘤細(xì)胞免受血流剪切應(yīng)力的影響[24]，使循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞增多，導(dǎo)致癌性血栓發(fā)生率增高[24-25]。Shirai等[23]研究發(fā)現(xiàn)，CLEC-2缺失小鼠腫瘤血管中的血栓形成減少，肺栓塞發(fā)生率降低。一項(xiàng)納入了285例惡性腦腫瘤患者的前瞻性研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞PDPN陽性表達(dá)患者的血小板計(jì)數(shù)降低、D-二聚體水平升高，PDPN高表達(dá)患者的半年、1年、2年累積靜脈血栓發(fā)生率分別為18.4%、25.7%、25.7%，均高于PDPN低表達(dá)患者(分別為8.7%、10.3%、14.6%)[26]。以上研究證實(shí)CLEC-2與PDPN相互作用能明顯影響癌癥患者的預(yù)后。目前已有研究嘗試通過研發(fā)干預(yù)CLEC-2與PDPN相互作用的藥物來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及癌性血栓形成，進(jìn)而改善患者的生存狀況[27]。

5 總結(jié)與展望

CLEC-2可介導(dǎo)多種病理狀態(tài)下的血栓形成(圖2)，但CLEC-2特異性缺失并不影響正常止血[28]，這將為許多血栓栓塞性疾病提供新的治療手段。目前研究仍存在不足：(1)目前的研究多為動(dòng)物模型研究，尚欠缺臨床研究。(2)小鼠與人體的CLEC-2表達(dá)有所差異。人體中CLEC-2只存在于血小板、巨核細(xì)胞及肝臟中；小鼠中CLEC-2還表達(dá)于一些免疫細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞、外周中性粒細(xì)胞、炎性巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及B細(xì)胞[2]。(3)小鼠血小板表達(dá)ITAM通路的受體只有GPⅥ及CLEC-2，而人類血小板還包含蛋白質(zhì)人免疫球蛋白G Fc段Ⅱ型受體(FcγRⅡA)[15]，故小鼠實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論未必適用于人體。未來可從以上三個(gè)方面或通過其他作用機(jī)制開展進(jìn)一步研究，以使CLEC-2更有效地應(yīng)用于臨床實(shí)踐，發(fā)揮更好的治療作用。

圖2 CLEC-2介導(dǎo)血栓形成的主要途徑Fig.2 Major pathways of CLEC-2 mediating thrombosis