袁向科，江瑞

1河南省中醫(yī)院周圍血管科，鄭州 450002；2河南省中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院老年病科，鄭州 450002

血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是動脈硬化發(fā)生的始動因素。正常情況下，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整、功能正常；而氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)的沉積會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷、單核細胞浸潤、血小板黏附聚集，并刺激血管平滑肌細胞向血管內(nèi)膜遷移及增殖，巨噬細胞吞噬脂質(zhì)而形成泡沫細胞，逐漸發(fā)展為動脈粥樣硬化性斑塊[1-2]。ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷模型廣泛用于動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究[3-4]。青蒿素(artemisinin，ART)是從菊科植物黃花蒿中提取的倍半萜內(nèi)酯化合物。研究表明，ART可促進巨噬細胞的自噬，減輕炎癥反應(yīng)，進而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[5-7]，還可延緩ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的進展[8]。但是，ART在內(nèi)皮細胞損傷中的作用及其機制目前尚未明確。本研究通過構(gòu)建ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷模型，探討ART對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其潛在機制，旨在為動脈粥樣硬化的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞E A.hy926購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；ART、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、瞬時感受器電位通道香草酸受體亞型Ⅳ(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)阻斷劑釕紅(ruthenium red，RR)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；ox-LDL、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗(含100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)購自上海生工生物工程有限公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液、Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ多克隆抗體、兔抗人p62多克隆抗體、兔抗人Bcl-2/Bax多克隆抗體、兔抗人TRPV4多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體及HRP-IgG羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理 將人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞融合至70%～80%時用0.25%胰蛋白酶消化，1:3傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期EA.hy926細胞，分別用0、50、100、150、200 mg/ml的ox-LDL誘導(dǎo)，接種于96孔板，24 h后收集細胞，MTT法檢測細胞活性。取對數(shù)生長期EA.hy926細胞，分別用0、1、5、10、20 mmol/L的ART處理細胞，接種于96孔板，24 h后收集細胞，MTT法檢測細胞活性。為檢測ART對細胞的影響，將對數(shù)生長期EA.hy926細胞隨機分為4組：對照組(無處理)、ox-LDL組(100 mg/ml ox-LDL)、ox-LDL+ART組(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART)及ox-LDL+ART+3-MA組(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+5 mmol/L 3-MA)。為檢測TRPV4對細胞的影響，將對數(shù)生長期EA.hy926細胞隨機分為4組：對照組、ox-LDL組、ox-LDL+ART組及ox-LDL+ART+RR組(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+10 mmol/L RR)。按分組處理細胞后接種于96孔板，24 h后收集細胞，MTT法檢測細胞活性，Western blotting檢測蛋白表達水平，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 收集各處理組細胞，每孔加5 g/L MTT工作液20 μl，于37 ℃孵育4 h，吸棄上清液；加入DMSO混勻，采用酶標(biāo)儀檢測各孔在550 nm波長處的吸光度(OD)值，計算細胞活性。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3 Western blotting檢測蛋白的表達 收集各處理組細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量；以40 mg蛋白量上樣，10% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Bcl-2、Bax、TRPV4及β-actin等抗體孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育4 h，TBST洗膜；ECL發(fā)光液顯色曝光。蛋白表達水平以條帶灰度值表示，以β-actin為內(nèi)參照。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各處理組細胞，PBS反復(fù)沖洗；加入500 μl結(jié)合緩沖液，用5 μl Annexin V-FITC室溫下避光孵育15 min，再加入5 μl PI孵育5 min；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞活性的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，隨著ox-LDL濃度的升高，EA.hy926細胞活性逐漸降低(P＜0.05)，采用0、1、5、10、20 mmol/L的ART處理EA.hy926細胞24 h后，EA.hy926細胞活性無明顯變化(P＞0.05，圖1)。與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組、ox-LDL+ART+3-MA組的EA.hy926細胞活性明顯降低；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組細胞活性明顯升高；與ox-LDL+A RT組比較，ox-LDL+ART+3-MA組細胞活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.2 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞自噬的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組EA.hy926細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均增高；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，ox-LDL+ART+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組EA.hy926細胞中p62蛋白表達水平降低，ox-LDL+ART+3-MA組p62蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組p62蛋白表達水平降低，ox-LDL+ART+3-MA組p62蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+3-MA組的p62蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

圖1 不同濃度ox-LDL、ART對EA.hy926細胞活性的影響(n=3)Fig.1 Effect of different concentrations of ox-LDL and ART on the viability of EA.hy926 cells (n=3)

圖2 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞活性的影響(n=3)Fig.2 Effect of ART on the viability of EA.hy926 cells induced by ox-LDL (n=3)

2.3 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組、ox-LDL+ART+3-MA組的EA.hy926細胞凋亡率均明顯增高；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組的細胞凋亡率明顯降低，ox-LDL+ART+3-MA組的細胞凋亡率明顯增高，且ox-LDL+ART+3-MA組的細胞凋亡率明顯高于ox-LDL+ART組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4A、B)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART+3-MA組凋亡因子Bcl-2的表達水平降低，Bax的表達水平升高；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組Bcl-2的表達水平升高，Bax的表達水平降低，ox-LDL+ART+3-MA組Bax的表達水平升高；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+3-MA組Bcl-2的表達水平降低，Bax的表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4C、D)。

圖3 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞自噬的影響(Western blotting，n=3)Fig.3 Effect of ART on the autophagy of EA.hy926 cells induced by ox-LDL (Western blotting, n=3)

圖4 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞凋亡的影響(n=3)Fig.4 Effect of ART on the apoptosis of EA.hy926 cells induced by ox-LDL (n=3)

2.4 ART對血管內(nèi)皮細胞TRPV4表達及自噬的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART+RR組TRPV4蛋白表達水平明顯降低；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組TRPV4蛋白表達水平明顯升高；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+RR組TRPV4蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，p 6 2 蛋白表達水平明顯降低，ox-LDL+ART+RR組的p62蛋白表達水平明顯降低；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，p 6 2 蛋白表達水平明顯降低，

ox-LDL+ART+RR組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+RR組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，p62蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖6)。

圖5 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞TRPV4蛋白表達水平的影響(n=3)Fig.5 Effect of ART on the protein expression of TRPV4 in EA.hy926 cells induced by ox-LDL (n=3)

圖6 ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞自噬的影響(n=3)Fig.6 Effect of ART on the autophagy of EA.hy926 cells induced by ox-LDL (n=3)

2.5 抑制TRPV4對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞活性及細胞凋亡的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組、ox-LDL+ART+RR組細胞活性明顯降低；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組細胞活性明顯升高；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+RR組細胞活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖7A)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART組、ox-LDL+ART+RR組細胞凋亡率均明顯增高；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組的細胞凋亡率明顯降低；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+RR組的細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖7B)。Western blotting檢測結(jié)果表明，與對照組比較，ox-LDL組、ox-LDL+ART+RR組凋亡因子Bcl-2的表達水平降低，Bax的表達水平升高；與ox-LDL組比較，ox-LDL+ART組Bcl-2的表達水平升高，Bax的表達水平降低；與ox-LDL+ART組比較，ox-LDL+ART+RR組Bcl-2的表達水平降低，Bax的表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖7C、D)。

3 討 論

外周血管動脈粥樣硬化是一個慢性炎癥反應(yīng)過程，是動脈損傷或者斑塊性內(nèi)皮損傷長期作用的結(jié)果。血管內(nèi)皮細胞作為緊貼血管壁的單層細胞，最易受到炎性細胞、氧化應(yīng)激及循環(huán)因子的損害[9]。近年來大量研究表明，血管內(nèi)皮細胞的損傷及功能改變是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)[10-12]。ox-LDL為血管內(nèi)皮凋亡誘導(dǎo)因子，抑制ox-LDL介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷有望成為預(yù)防或緩解動脈粥樣硬化進展的有效措施[13]。ART是從菊科植物黃花蒿中提取的一種低毒、有效的抗瘧藥，其結(jié)構(gòu)中存在內(nèi)過氧橋，斷裂后產(chǎn)生的碳中心自由基分子及活性氧(ROS)是其發(fā)揮藥理作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[14]。近年來，對ART的研究已經(jīng)從抗瘧疾治療擴展到抗炎、抗腫瘤及抑制血管新生等[15]。已有研究表明，ART減輕了ApoE-/-基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化損傷[8]，但其防治動脈粥樣硬化的分子機制尚待進一步探索。本研究結(jié)果顯示，不同濃度ART單獨作用于EA.hy926細胞后，細胞活性無明顯變化，但ART能夠逆轉(zhuǎn)ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞EA.hy926活性的抑制作用。

圖7 抑制TRPV4對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞活性及細胞凋亡的影響(n=3)Fig.7 Effect of suppressing TRPV4 on the viability and apoptosis of EA.hy926 cells induced by ox-LDL (n=3)

細胞自噬是細胞通過溶酶體降解內(nèi)源性底物的重要生物學(xué)過程[16]，在細胞生存、組織分化、結(jié)構(gòu)重建及代謝平衡中發(fā)揮重要作用[17]，可幫助細胞應(yīng)對外界有害刺激，促進細胞存活，但過度自噬會導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性死亡。有研究表明，自噬與動脈粥樣硬化的發(fā)生直接相關(guān)，動脈粥樣硬化早期在氧化脂質(zhì)的刺激下，內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬，并通過自噬清除受損的線粒體，保護內(nèi)皮細胞功能[18-19]；但在動脈粥樣硬化晚期，斑塊繼續(xù)發(fā)展，內(nèi)皮細胞的過度自噬則可導(dǎo)致細胞死亡，不利于斑塊的穩(wěn)定[20-21]。ox-LDL、炎癥等與動脈粥樣硬化發(fā)生相關(guān)的因素均可引起細胞自噬。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL處理提高了EA.hy926細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，降低了p62蛋白表達水平，盡管ox-LDL作用早期可促進細胞自噬，但并不足以抑制其造成的細胞凋亡。ART進一步促進了ox-LDL對EA.hy926細胞的自噬作用；而自噬抑制劑3-MA可逆轉(zhuǎn)ART對ox-LDL誘導(dǎo)的細胞自噬促進作用；提示ART進一步激活了ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞自噬，進而抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡。

瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)通道是一類重要的陽離子通道家族。瞬時感受器電位通道香草酸受體(transient receptor potential vanilloid，TRPV)共有6個成員：TRPV1～TRPV6，廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，在機體的多種生理功能中發(fā)揮重要作用[22]。其中TRPV4激活可引起Ca2+內(nèi)流，觸發(fā)Ca2+依賴的生理反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管張力[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4激活抑制了腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞黏附，并減輕了ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成[24]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4可誘導(dǎo)肝星形細胞的自噬，進而抑制細胞凋亡[25]；敲低成骨細胞中的TRPV4則可通過抑制自噬而抑制成骨細胞的分化[26]。以上研究均提示TRPV4對細胞自噬有促進作用。本研究結(jié)果顯示，ART上調(diào)了ox-LDL誘導(dǎo)的TRPV4表達，應(yīng)用TRPV4阻斷劑后，ART對ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細胞自噬作用被反轉(zhuǎn)，表明ART通過激活TRPV4而促進ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞自噬。但ART是否可通過激活TRPV4而進入內(nèi)皮細胞尚未明確。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ART可通過上調(diào)TRPV4促進細胞自噬，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細胞損傷，為動脈粥樣硬化的治療提供了潛在靶點。然而ART激活TRPV4的機制尚不清楚，仍有待進一步研究。