夏紅，楊翔，陳燁，李虎，褚桂芬

廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院婦科，廣州 511040

宮頸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居第二位，嚴(yán)重危害女性健康[1]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源性RNA分子，轉(zhuǎn)錄后具有調(diào)控基因表達(dá)的作用[2-4]。circRNA在人體細(xì)胞中廣泛穩(wěn)定表達(dá)[5]，且在疾病發(fā)展過程中呈特異性表達(dá)，因此可成為腫瘤早期診斷與預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[6]。外泌體(exososme，EXs)是細(xì)胞內(nèi)起源的納米級(jí)細(xì)胞外脂質(zhì)雙層囊泡，其內(nèi)攜帶有多種活性物質(zhì)，如circRNA、miRNA、mRNA及特異性的蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性[7-8]。此外，大量研究表明，外泌體作為信號(hào)分子載體，可參與細(xì)胞間信息傳遞，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。有研究表明，外泌體中含有比分泌細(xì)胞更多的circRNA，且這一分泌可被miRNA調(diào)控[11-12]。因此，外泌體中circRNA的多樣性和特異性使其能夠用于腫瘤的輔助診斷，也可用于監(jiān)控腫瘤的進(jìn)展，近年來備受關(guān)注。本研究探討了hsa_circ_0087432在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，提出hsa_circ_0087432可能是通過癌細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)宮頸鱗癌侵襲與轉(zhuǎn)移的假設(shè)，以此來探討外泌體中的circRNA對(duì)宮頸鱗癌診療的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及材料 收集廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院2019年6月－2020年6月診斷為宮頸鱗癌且術(shù)前未行放化療的30例患者的宮頸癌組織及血清作為實(shí)驗(yàn)組，30例未患宮頸癌的女性正常宮頸組織及血清作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過番禺區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。Siha細(xì)胞(人宮頸鱗癌細(xì)胞)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。胎牛血清、0.25%EDTA胰蛋白酶溶液、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、PBS均購自美國Gibco公司；MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000試劑、Western blotting相關(guān)試劑及BCA蛋白定量試劑盒、熒光定量PCR儀(ABI 7500)購自美國ThermoFisher公司；CD9、CD63和CD81抗體購自美國Abcam公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛購自武漢賽維爾生物科技有限公司；外泌體RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞外泌體提取試劑購自廣州市銳博生物科技有限公司；PKH-26染料購自美國Sigma公司；hsa_circ_0087432過表達(dá)質(zhì)粒載體hsa_circ_0087432-pLC5-ciR和其空載體pLC5-ciR購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；GAPDH、hsa_circ_0087432引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，宮頸癌細(xì)胞株(Siha)用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。Siha細(xì)胞按不同處理分為3組：control組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，vector組(轉(zhuǎn)染pLC5-ciR)和hsa_circ_0087432組(轉(zhuǎn)染hsa_circ_0087432-pLC5-ciR)，轉(zhuǎn)染流程按照說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24～48 h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，拍照。qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后hsa_circ_0087432的表達(dá)。

1.2.2 外泌體分離、鑒定及內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)其攝取的檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，更換為10%無外泌體血清的完全培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞上清，以備后續(xù)提取外泌體。參照外泌體提取試劑說明書提取外泌體，適量PBS重懸外泌體，取10 μl采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，其余置入–80 ℃冰箱保存。采用透射電子顯微鏡鑒定外泌體形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)技術(shù)測定外泌體粒徑范圍。Western blotting檢測外泌體生物標(biāo)志物CD9、CD63及CD81的表達(dá)情況。提取外泌體總蛋白，以每孔20 μg上樣電泳，完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，封閉后加入一抗，置于4 ℃冰箱孵育過夜。第2天孵育二抗1 h，TBST洗膜3次后，加顯影液曝光蛋白條帶，統(tǒng)計(jì)分析灰度值。

參照PKH26染料說明書按比例標(biāo)記外泌體，提純?cè)俅沃貞液?，加入培養(yǎng)基中與內(nèi)皮細(xì)胞避光共培養(yǎng)24 h，PBS洗3次；4%多聚甲醛溶液固定后，PBS洗3次；DAPI染色5～10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅封片劑封片后，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.3 血清外泌體RNA的提取 血清按收集的來源不同分為宮頸癌組與對(duì)照組。提取方法參照血清外泌體RNA提取試劑盒說明書，完成后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用SYBR?Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

1.2.4 宮頸組織RNA的提取 宮頸組織按收集的來源不同分為宮頸癌組與對(duì)照組。采用Trizol法提取組織中的總RNA，稱取組織，每10 mg組織加入1 ml Trizol試劑，加入研磨鋼珠后放在研磨機(jī)內(nèi)研磨，全程冰上操作。然后參照細(xì)胞總RNA提取操作步驟，得到總RNA，測定濃度后，根據(jù)試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用SYBR?Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

1.2.5 qPCR檢測 采用SYBR?Green法，操作步驟按照試劑盒說明，配制總反應(yīng)體積為20 μl的反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列(5'-3')如下：GAPDH正義AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反義GCAGG AGGCATTGCTGATGAT；hsa_circ_0087432正義CG CATTATGCCTGATTCCAA，反義CTGCTGGACTAG GGTGAAAA；hsa_circ_0081672正義TTTACCAACG CCATCACCGA，反義CCCAGTGTGTGGTCTTCTT TGT；hsa_circ_0075430正義CAGCACACGGCGGA AGAAA，反義CCCCTGATTGTGACCTTCGT。qPCR結(jié)果采用2–ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提前1 d接種于96孔板上，按不同處理分為3組：control-Exs組(siha細(xì)胞外泌體)、hsa_circ_0087432-Exs組(hsa_circ_0087432組siha細(xì)胞外泌體)、vector-Exs組(vector組siha細(xì)胞外泌體)，每組6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞數(shù)3×103個(gè)/孔。細(xì)胞貼壁后，按照分組加入外泌體干預(yù)48 h，更換含有CCK-8工作液的培養(yǎng)基(CCK-8工作液與培養(yǎng)基配制比例為1:10)，每孔100 μl，37 ℃避光孵育1.5～2.0 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況 分組同1.2.6。提前1 d接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞于6孔板上，每孔保持等量的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，融合至90%時(shí)，取200 μl無菌槍頭，在6孔板上劃線，PBS洗去細(xì)胞碎片，更換含1%血清的完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入外泌體，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。劃痕后0、12、24 h后分別對(duì)劃痕處進(jìn)行拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力 分組同1.2.6。細(xì)胞同步化12 h后，胰酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞，小室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸液及外泌體，培養(yǎng)液為含0.5%血清的完全培養(yǎng)基，下室加入400 μl含20%血清的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24～48 h，用棉簽擦去內(nèi)室的細(xì)胞，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)小室底部濾膜下層穿過的細(xì)胞數(shù)，每組計(jì)數(shù)5個(gè)視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，hsa_circ_0087432在宮頸癌和正常組織及血清外泌體中的表達(dá)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；符合方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組宮頸組織和血清外泌體中hsa_circ_0087432的表達(dá)水平比較 qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組患者宮頸組織中hsa_circ_0087432表達(dá)量(4.03±1.51)明顯高于對(duì)照組(1.00±0.26，P＜0.01)；兩組hsa_circ_0081672及hsa_circ_0075430的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1A)。此外，實(shí)驗(yàn)組血清外泌體中hsa_circ_0087432的表達(dá)量(1.97±0.04)明顯高于對(duì)照組(1.02±0.23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1B)。

2.2 外泌體形態(tài)、特征蛋白鑒定及細(xì)胞攝取 分別收集control組、vector組及hsa_circ_0087432組Siha細(xì)胞的上清提取外泌體。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Siha細(xì)胞的胞外囊泡大部分呈橢圓形或圓形(圖2A)，粒徑分析顯示上清中提取的囊泡顆粒直徑大小分布在30～150 nm(圖2B)，Western blotting結(jié)果顯示control組及hsa_circ_0087432組囊泡中的CD9、CD81及CD63表達(dá)均呈陽性(圖2C)，表明提取的細(xì)胞外囊泡為外泌體。PKH-26標(biāo)記的外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，外泌體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞核周圍分布，說明外泌體可以很好地被細(xì)胞攝取(圖2D)。

2.3 過表達(dá)hsa_circ_0087432的外泌體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 qPCR結(jié)果顯示，與vector-Exs組(2.29±0.21)相比，hsa_circ_0087432-Exs組hsa_circ_0087432表達(dá)量(11.39±1.71)明顯升高(P＜0.001)，提示成功轉(zhuǎn)染。CCK-8檢測結(jié)果顯示，hsa_circ_0087432-Exs組細(xì)胞活力(1.57±0.04)明顯高于control-Exs組(1.09±0.11)及vector-Exs組(1.27±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組宮頸組織(A)及血清外泌體(B)中hsa_circ_0087432的表達(dá)水平Fig.1 The expression level of hsa_circ_0087432 in cervical tissue (A) and serum exosomes (B) in experimental group and control group

圖2 外泌體電鏡圖、粒徑分析、特征蛋白的鑒定及細(xì)胞內(nèi)攝取Fig.2 Exosomes, particle size, identification of characteristic proteins and intracellular uptake

2.4 過表達(dá)hsa_circ_0087432的外泌體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)12 h后，hsa_circ_0087432-Exs組的遷移面積占比(24.66%±2.92%)高于control-Exs組(15.01%±3.12%)及vector-Exs組(18.07%±4.34%)；干預(yù)24 h后，hsa_circ_0087432-Exs組的遷移面積占比(74.84%±13.22%)明顯高于control-Exs組(38.70%±2.12%)及vector-Exs組(35.02%±4.43%，P＜0.05或P＜0.01，圖3A、C)。Transwell檢測結(jié)果顯示，與vector-Exs組[(1218.00±103.53)個(gè)]及control-Exs組[(1044.00±103.79)個(gè)]比較，hsa_circ_0087432-Exs組遷移細(xì)胞數(shù)量[(1755.00±97.35)個(gè)]明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3B、D)。

圖3 過表達(dá)hsa_circ_0087432后細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Exocrine derived from the cells which over-pressing the hsa_circ_0087432 can promote the proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells

3 討 論

circRNA是一種內(nèi)源性RNA，可作為miRNA海綿或競爭性內(nèi)源性RNA參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000069可通過海綿作用吸附miR-873-5p，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因TUSC3的表達(dá)，參與宮頸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Ma等[15]也發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005576可與miR-153相互作用，上調(diào)KIF20A的表達(dá)，以此促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。目前，circRNA已被證實(shí)在腫瘤組織及細(xì)胞中呈異常表達(dá)，極可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。另外，circRNA還可通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)[16]等影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_PVT1可通過靶向miR-1286誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的EMT，促進(jìn)宮頸癌的遷移侵襲。朱小青和羅楓[18]在GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織與正常宮頸組織中119種差異表達(dá)的circRNA，分析發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展可能與hsa_circ_0031027/hsa-miR-132-3p/KLHL11及hsa_circ_0075341/hsa-miR-4747-5p/LY6G6C兩條調(diào)控途徑有關(guān)。Jiao等[19]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)E-cadherin可降低hsa_circ_0000745的表達(dá)水平，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

外泌體內(nèi)含有大量生物活性物質(zhì)，如circRNA、miRNA、mRNA及蛋白質(zhì)等，可作為細(xì)胞間信息交流傳遞的載體。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤外泌體與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這提示其有望成為臨床診療的指標(biāo)[20-21]。Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)外泌體中的miR-221-3p可下調(diào)VASH1的表達(dá)，促進(jìn)淋巴、血管發(fā)生，與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的癌區(qū)淋巴管密度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目有關(guān)。還有學(xué)者通過對(duì)血漿外泌體miRNA測序及組織PCR進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血漿外泌體中l(wèi)et-7d-3p、miR-30d-5p與健康人的表達(dá)存在差異，可作為診斷生物標(biāo)志物用于宮頸癌及其前體的非侵入性篩查指標(biāo)[23]。崔虎軍等[24]發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA29在宮頸癌轉(zhuǎn)移中有重要作用。

本研究通過qPCR法證實(shí)了hsa_circ_0087432在宮頸癌患者癌組織與正常組織中的表達(dá)存在差異，且在患者與健康人血清外泌體中的表達(dá)也存在差異，提示hsa_circ_0087432可能是通過癌細(xì)胞分泌至外泌體，并參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。根據(jù)這一結(jié)果，本研究通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞，過表達(dá)了細(xì)胞中的hsa_circ_0087432，收集其細(xì)胞上清后提取外泌體，并在內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證。CCK-8檢測結(jié)果證實(shí)，來源于過表達(dá)hsa_circ_0087432的細(xì)胞的外泌體可更明顯地提高內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，過表達(dá)hsa_circ_0087432后提取的外泌體可更好地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。以上結(jié)果均提示宮頸癌患者外泌體中的hsa_circ_0087432參與了宮頸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0087432在宮頸癌患者組織和血清中高表達(dá)，且有可能通過外泌體的方式促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為以后的研究提供了新的線索和思路。但以上數(shù)據(jù)僅表明hsa_circ_0087432參與了宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程，并未深入探討其對(duì)宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等的具體機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。