智 鵬，張皓旻，王毅興，遲小華，陳浩然，陳熙勐，張鈞棟，李卓陽，劉格良，楊 波，葉 芳，盧學(xué)春

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情仍未結(jié)束，全球多個(gè)國家均出現(xiàn)了確診和疑似病例[1]。COVID-19患者病情進(jìn)展快，預(yù)后差，病死率高，給患者臨床診療帶來巨大挑戰(zhàn)[2]。研究表明，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）序列高度同源且體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)一致[3]。生物信息學(xué)分析與藥物預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，西多福韋對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）具有潛在治療作用，且治療靶點(diǎn)與mTOR、IL-17等信號(hào)通路有關(guān)[4-5]。據(jù)此推測(cè)西多福韋對(duì)SARS-CoV-2可能具有類似作用。為探明西多福韋治療COVID-19的潛在分子機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)方法，篩選關(guān)鍵治療信號(hào)分子及通路進(jìn)行研究，以期為COVID-19臨床治療藥物選擇提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選與提取 本研究以“cidofovir”為關(guān)鍵詞，在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus,GEO）中檢索，篩選至少包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)且物種為人或小鼠的數(shù)據(jù)，將西多福韋治療組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，未治療組設(shè)為對(duì)照組。

1.2 差異表達(dá)基因識(shí)別 在bioconductor網(wǎng)站（http//:www.bioconductor.org）下載R語言程序，利用 Impute 程序包對(duì)已獲取的基因表達(dá)譜進(jìn)行歸一化處理。利用注釋包對(duì)數(shù)據(jù)注釋，將探針對(duì)應(yīng)到基因上進(jìn)行匹配（若多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因，則取多個(gè)探針表達(dá)量的平均值作為該基因的表達(dá)量）。利用Impute 程序包將基因注釋結(jié)果與表達(dá)量整合，得到2組數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)譜，用于后續(xù)分析；利用 Limma 程序包，以|logFC|＞1，F(xiàn)DR＜0.05作為閾值，篩選實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因。

1.3 富集分析 采用基因本體論 （gene ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。采用Fisher確切概率法，以FDR＜0.05，P＜0.05作為篩選條件，獲得差異表達(dá)基因GO富集的生物學(xué)進(jìn)程（biological processes,BP）、細(xì)胞組分（cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）和KEGG富集的通路。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 使用STRING開源數(shù)據(jù)庫對(duì)前述差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作（proteinprotein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)，以可靠性閾值＞0.4作為截?cái)嘀迪螺d數(shù)據(jù)，隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape可視化分析軟件，使用CytoHubba 插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中基因節(jié)點(diǎn)進(jìn)行得分計(jì)算，以Degree≥6 作為閾值，選取Degree 值前10位基因作為核心基因。

1.5 EpiMed關(guān)聯(lián)分析 利用課題組前期自主研發(fā)的臨床生物信息學(xué)表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測(cè)平臺(tái)（epigenomic precision medicine prediction platform,EpiMed）篩選與西多福韋關(guān)聯(lián)的疾病和藥物，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度為正值即為正相關(guān)，負(fù)值即為負(fù)相關(guān)[6-7]。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)選擇 共檢索到4篇“cidofovir”相關(guān)文章[8-11]，涉及4組數(shù)據(jù)，120個(gè)樣本，最終選擇GSE39293數(shù)據(jù)集中西多福韋作用于原發(fā)性人角質(zhì)化細(xì)胞的數(shù)據(jù)，見表1。

表1 數(shù)據(jù)基本情況Table 1 Basic information of data

2.2 差異表達(dá)基因識(shí)別 歸一化后數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因篩選中，共發(fā)現(xiàn)585 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因494個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因91個(gè)，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因分析紅色為上調(diào)差異表達(dá)基因，綠色為下調(diào)差異表達(dá)基因，黑色為未達(dá)到篩選閾值的基因Figure 1 Analysis of differentially expressed genes

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 GO 富集分析結(jié)果顯示，富集BP 42條，CC 11條，MF 0條。相關(guān)基因有IFIT3、OAS1、ISG15、IFIT1、IFIT2、Mx2 等。BP方面主要富集條目為干擾病毒復(fù)制、I型干擾素作用、免疫調(diào)節(jié)等；CC方面主要富集條目為核小體組裝、DNA復(fù)合物、有絲分裂紡錘體中央?yún)^(qū)等，見圖2。

圖2 GO富集分析選擇富集基因數(shù)量排名前10的進(jìn)行展示；橙色代表BP，藍(lán)色代表CC，橫坐標(biāo)為富集的基因數(shù)量，縱坐標(biāo)為GO富集條目Figure 2 GO enrichment analysis

2.3.2 KEGG富集分析 富集KEGG通路共244條，主要富集條目為抗病毒、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)，凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路等。相關(guān)基因有CXCL8、CCL20、MMP1、SLC7A5、EIF4EBP1 、SESN2、CFHR1、CFH、PLAT等。抗病毒相關(guān)信號(hào)通路包括HIV-1感染信號(hào)通路、堿基切除修復(fù)、DNA復(fù)制等，其中HIV-1感染信號(hào)通路見圖3；抗凋亡相關(guān)信號(hào)通路包括p53、鐵死亡、JAK-STAT等，其中JAK-STAT通路見圖4；免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、IL-17、mTOR等，其中IL-17信號(hào)通路見圖5；凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路包括葉酸生物合成、補(bǔ)體與凝血系統(tǒng)等，其中補(bǔ)體與凝血系統(tǒng)信號(hào)通路見圖6。

圖3 抗病毒相關(guān)信號(hào)通路紅色表示差異表達(dá)基因上調(diào)，綠色表示差異表達(dá)基因下調(diào)Figure 3 Anti virus related signaling pathway

圖4 抗凋亡相關(guān)信號(hào)通路紅色表示差異表達(dá)基因上調(diào)，綠色表示差異表達(dá)基因下調(diào)Figure 4 Anti-apoptosis related signaling pathway

圖5 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路紅色表示差異表達(dá)基因上調(diào)，綠色表示差異表達(dá)基因下調(diào)Figure 5 Immunomodulatory signaling pathway

圖6 凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路紅色表示差異表達(dá)基因上調(diào)，綠色表示差異表達(dá)基因下調(diào)Figure 6 Coagulation system related signaling pathway

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，共得到514個(gè)蛋白，715條相互關(guān)系，平均點(diǎn)度2.78。對(duì)核心基因進(jìn)行篩選，排名前10位核心基因分別為CDK1、CCNA2、CDC6、KIF11、MAD2L1、NDC80、RRM2、ASPM、NCAPG、CENPU，見圖7。

圖7 關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心基因統(tǒng)計(jì)圖A．PPI網(wǎng)絡(luò)；B.排名前10位的核心基因Figure 7 Key gene in PPI network and statistical chart of hub genes

2.5 EpiMed關(guān)聯(lián)分析 EpiMed預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，西多福韋與SARS、肺炎等疾病呈負(fù)相關(guān)，與利巴韋林、α-干擾素等藥物呈正相關(guān)，與諾氟沙星、衣霉素等抗生素呈負(fù)相關(guān)，見表2。

表2 EpiMed關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 2.Results of EpiMed correlation analysis

3 討 論

本研究以西多福韋相關(guān)全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)為研究對(duì)象，經(jīng)臨床生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)西多福韋可對(duì)大量基因表達(dá)模式產(chǎn)生影響，尤其以CDK1等細(xì)胞周期相關(guān)分子最為顯著，與以往研究結(jié)果一致[12-14]。此外，富集分析結(jié)果顯示，上述分子表達(dá)水平變化可能與抗病毒、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)和凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)，針對(duì)以上信號(hào)通路開展研究有望揭示西多福韋治療COVID-19的組學(xué)機(jī)制。

既往研究表明，包括SARS-CoV、SARSCoV-2等在內(nèi)的RNA病毒可通過干擾宿主組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑機(jī)制或編碼與宿主組蛋白直接相互作用的病毒蛋白，進(jìn)而干擾和拮抗宿主先天免疫反應(yīng)[15]。本研究GO富集分析發(fā)現(xiàn)，西多福韋調(diào)控基因中有大量與干擾病毒復(fù)制、I型干擾素作用、免疫調(diào)節(jié)等作用相關(guān)的分子，例如IFIT3、OAS1、ISG15等。Carey等[16]發(fā)現(xiàn)，OAS1結(jié)合入侵病毒雙鏈RNA，可產(chǎn)生2'-5'連接的寡聚腺苷酸，以激活核糖核酸酶，裂解RNA，抑制病毒復(fù)制。同時(shí) OAS1還可以通過宿主RNA進(jìn)行自動(dòng)激活，從而發(fā)揮抗病毒作用；除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)大量西多福韋調(diào)控基因富集于I型干擾素作用的BP中，例如 IFIT1、IFIT2、Mx2等。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)IFIT1、IFIT2等產(chǎn)生后，可通過干擾病毒包膜與宿主膜融合，直接發(fā)揮抑制病毒作用；Haller與Fuchs等[18-19]發(fā)現(xiàn)，Mx2等Mx家族蛋白可作為干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生ISG家族的激動(dòng)劑，對(duì)多數(shù)RNA和DNA病毒初期復(fù)制具有廣泛抑制作用。因此，本研究推測(cè)西多福韋可以通過上述分子調(diào)控的BP發(fā)揮抗SARS-CoV-2的作用。

此外，西多福韋影響的信號(hào)通路主要與抗病毒、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)及凝血系統(tǒng)相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，西多福韋可通過誘導(dǎo)病毒感染相關(guān)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮治療作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)大量基因富集于p53、鐵死亡、JAK-STAT等抗凋亡相關(guān)信號(hào)通路，推測(cè)西多福韋可通過上述信號(hào)通路誘導(dǎo)感染SARS-CoV-2的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用?，F(xiàn)已證實(shí)，冠狀病毒感染人體后可通過IL-17、mTOR等免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎因子釋放，同時(shí)影響CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞功能進(jìn)而發(fā)生異常凋亡、分化及遷移[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，西多福韋可通過mTOR、IL-17信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在IL-17信號(hào)通路中，CXCL8、CCL20、MMP1是西多福韋的主要作用對(duì)象，推測(cè)西多福韋可通過這些分子影響IL-17信號(hào)通路進(jìn)而抑制促炎因子的釋放，改善SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的相關(guān)免疫失調(diào)問題。同時(shí)，西多福韋可通過SLC7A5、EIF4EBP1 、SESN2等分子對(duì)mTOR信號(hào)通路產(chǎn)生影響，推測(cè)與COVID-19患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞遷移密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19重癥患者常出現(xiàn)膿毒癥休克及凝血功能異常，其潛在機(jī)制除與體內(nèi)病毒大量復(fù)制及免疫反應(yīng)有關(guān)外，可能還與凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路的功能異常密切相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，西多福韋可對(duì)葉酸生物合成、補(bǔ)體與凝血系統(tǒng)等凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生影響，CFHR1、CFH、PLAT等分子可作為西多福韋調(diào)控凝血功能的主要分子，與既往研究結(jié)果一致[26]?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測(cè)西多福韋對(duì)重型COVID-19患者的免疫失調(diào)、凝血功能異常等癥狀具有潛在治療作用。

再者，基于EpiMed開展的疾病和藥物關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，與疾病呈負(fù)相關(guān)表示該藥物可能對(duì)某疾病發(fā)揮治療作用；與藥物呈正相關(guān)表示該藥物具有與西多福韋類似的作用，且聯(lián)合用藥可發(fā)揮協(xié)同作用。與抗生素呈負(fù)相關(guān)表示該藥物與西多福韋聯(lián)合使用可能會(huì)加重病情[6-7]。在疾病關(guān)聯(lián)分析方面，西多福韋與肺炎、SARS等疾病呈負(fù)相關(guān)，提示西多福韋可能對(duì)上述疾病具有治療作用，因SARS-CoV與SARS-CoV-2序列高度同源，推測(cè)西多福韋對(duì)COVID-19具有類似治療作用。在藥物關(guān)聯(lián)分析方面，西多福韋與氟伐他汀、利巴韋林、α-干擾素、柴胡、黃芪等藥物呈正相關(guān)，推測(cè)可能與西多福韋作用類似且可與西多福韋聯(lián)合用藥。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[27]中亦包含上述藥物。同時(shí)，Reiner等[28]發(fā)現(xiàn)包括氟伐他汀在內(nèi)的他汀類藥物可能是SARS-CoV-2高效的抑制劑，與本研究結(jié)果一致。此外本研究發(fā)現(xiàn)，西多福韋與衣霉素、諾氟沙星等抗生素呈負(fù)相關(guān)。Becattini等[29]發(fā)現(xiàn)，抗生素會(huì)破壞共生種群之間的平衡，導(dǎo)致人類腸道菌群和下層黏膜物質(zhì)之間的交換減少；也可能會(huì)產(chǎn)生過敏、代謝綜合征、藥物療效降低等多種后果。以上都說明衣霉素、諾氟沙星等抗生素不僅不能與西多福韋聯(lián)合應(yīng)用，而且不建議用于COVID-19的治療。

本研究不足之處在于未能開展臨床試驗(yàn)和直接獲取SARS-CoV-2感染的開源數(shù)據(jù)，未來如能開展基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)，有望為COVID-19治療藥物與臨床方案的選擇及優(yōu)化提供指導(dǎo)。

綜上所述，西多福韋能夠?qū)C(jī)體全基因組產(chǎn)生影響，可能通過誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡降低體內(nèi)SARS-CoV-2數(shù)量；通過免疫調(diào)節(jié)、凝血系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)通路等對(duì)機(jī)體免疫失調(diào)及重型患者出現(xiàn)的凝血功能異常進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到治療COVID-19的作用。