國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)，中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)生物治療學(xué)專業(yè)委員會(huì)

一、概 述

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）是由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染導(dǎo)致的肺炎。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[1]，根據(jù)病情嚴(yán)重程度可分為輕型、普通型、重型和危重型?；颊咧饕R床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、腹瀉等癥狀。重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和（或）低氧血癥，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒、出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等。我國已將COVID-19納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的按照甲類傳染病管理的乙類傳染病。2020年1月30日，WHO將COVID-19列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，并于2020年2月28日將其傳播和影響的風(fēng)險(xiǎn)評估提高到最高等級。COVID-19作為亟待解決的重大公共衛(wèi)生事件，急需尋找安全有效的治療手段[2]。

SARS-CoV-2是有包膜的單股正鏈RNA病毒，呼吸道飛沫和密切接觸是其主要的傳播途徑，接觸病毒污染的物品也可造成感染。病毒的S蛋白通過與靶細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)散[3]。感染SARS-CoV-2后，多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重，多見于老年人、有慢性基礎(chǔ)疾病者、晚期妊娠和圍產(chǎn)期女性、肥胖人群等。造成患者肺組織損傷的主要原因包括：①病毒感染直接引起的病理改變，包括肺泡細(xì)胞腫脹、壞死、脫落等導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞損傷；②機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)引起的嚴(yán)重免疫紊亂，這在重型和危重型患者體內(nèi)表現(xiàn)尤為明顯。COVID-19的病理表現(xiàn)為：肺泡腔內(nèi)纖維素性滲出物聚集，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，肺透明膜形成，肺泡壁和細(xì)支氣管管壁纖維素性壞死[4-5]。肺臟毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷，會(huì)進(jìn)展為ARDS。除肺部病理損傷外，COVID-19患者尤其是重癥患者外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、血漿炎癥因子水平顯著升高[6]，最后會(huì)導(dǎo)致休克及多器官功能障礙甚至死亡[7-8]。

COVID-19的臨床診治主要依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[1]。主要治療手段包括對癥治療、抗病毒治療、呼吸支持治療、免疫治療以及中醫(yī)藥治療等。由于SARS-CoV-2系新發(fā)病毒，目前尚無特效的抗病毒藥物。前期研究顯示，洛匹那韋/利托那韋、瑞德西韋等抗病毒作用有限[9-10]。對于重型與危重型患者，應(yīng)積極防治并發(fā)癥，及時(shí)進(jìn)行呼吸支持治療。中醫(yī)治療方面可根據(jù)患者病情、體質(zhì)因素以及當(dāng)?shù)貧夂虻冗M(jìn)行辨證論治。

免疫治療的目的是遏制炎癥細(xì)胞的聚集性浸潤、降低炎癥因子水平和恢復(fù)免疫系統(tǒng)平衡。當(dāng)前，免疫治療方法主要包括：①針對炎癥因子效應(yīng)的抗炎癥因子治療。目前IL-1家族阻斷劑、抗IL-6抗體等正處于臨床試驗(yàn)階段[11-12]。針對機(jī)體系統(tǒng)性免疫紊亂與耗竭，也有利用抗PD-1單克隆抗體等免疫檢查點(diǎn)抑制劑來逆轉(zhuǎn)COVID-19免疫耗竭的臨床研究。②康復(fù)者恢復(fù)期血漿治療?？共《局泻涂贵w通過與SARS-CoV-2表面蛋白相結(jié)合，可有效阻止SARS-CoV-2感染細(xì)胞[13]，已成為有效控制病毒復(fù)制、短期內(nèi)迅速改善癥狀的重要手段[14]。③干細(xì)胞治療。COVID-19疫情爆發(fā)以來，國內(nèi)外已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)完成了干細(xì)胞治療COVID-19的I期和II期臨床試驗(yàn)，III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中?，F(xiàn)有結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）治療COVID-19安全性良好，在縮短病程、減輕肺部損傷、降低炎癥因子水平等方面顯示出較好的臨床療效[15-19]。

二、MSC治療COVID-19的科學(xué)依據(jù)

MSC是一群來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有多向分化、促進(jìn)組織器官修復(fù)和免疫調(diào)控等潛能。MSC可從骨髓、臍帶、胎盤、脂肪、骨骼、牙髓和子宮內(nèi)膜等多個(gè)組織中分離，MSC樣細(xì)胞也可由胚胎干細(xì)胞或多能干細(xì)胞分化而來[20-21]。MSC具有低免疫原性，因不表達(dá)CD40、CD80、CD86等共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子，所以引起免疫排斥反應(yīng)的可能性較小[22]。同時(shí)因其對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)不受主要組織相容性復(fù)合體分子的限制，對自體和異體的免疫細(xì)胞都可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。MSC還具有炎癥趨化特性，通過感知炎性信號（細(xì)胞因子、趨化因子受體和整合素等）而遷移至炎癥部位，依賴細(xì)胞間直接接觸和（或）旁分泌效應(yīng)而發(fā)揮作用[23]，如MSC可通過細(xì)胞間直接接觸或分泌細(xì)胞因子的方式對激活的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的增殖、分化和抗體產(chǎn)生等發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)[24]。

有研究顯示，外周靜脈輸入MSC后，1 h內(nèi)約50%～60%的細(xì)胞停留在肺組織內(nèi)，3 h后數(shù)量降至約30%，48 h后MSC會(huì)在肝臟和脾臟內(nèi)聚集，10 d后仍可檢測到細(xì)胞滯留[25]。MSC聚集在肺組織可分泌細(xì)胞營養(yǎng)因子如角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor,KGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）等，促進(jìn)II型肺泡上皮細(xì)胞再生，改善肺部微環(huán)境，促進(jìn)ARDS損傷后肺泡上皮屏障的修復(fù)[21]。

目前已開展了多項(xiàng)MSC治療肺損傷的臨床研究。其中已報(bào)道的MSC治療ARDS的臨床研究超過15項(xiàng)，患者多為需要機(jī)械輔助通氣的危重型呼吸衰竭患者[26-29]。輸注細(xì)胞劑量從1×106cells/kg至1×107cells/kg不等，輸注途徑以外周靜脈為主[30]。臨床研究中未觀察到明顯不良反應(yīng)。在肺部滲出明顯階段，MSC有助于改善氧合指數(shù)，降低肺部的炎性損傷，提示MSC治療對ARDS有一定的治療作用。除ARDS外，也開展了多項(xiàng)MSC治療特發(fā)性或放射性損傷引起的肺纖維化的臨床研究[31-32]，初步結(jié)果顯示患者耐受性良好，細(xì)胞治療后纖維化無明顯進(jìn)展，6個(gè)月后各項(xiàng)肺功能指標(biāo)穩(wěn)定。對于H1N1、H5N1和H7N9等病毒感染引起嚴(yán)重肺損傷疾病，MSC可作為控制炎癥、改善肺損傷的重要輔助手段[33-35]。

三、MSC治療COVID-19的臨床研究進(jìn)展

目前，國內(nèi)外已完成多項(xiàng)MSC治療COVID-19的臨床研究，超過10項(xiàng)研究結(jié)果已發(fā)表。李蘭娟等[36]報(bào)道，2例重癥患者接受每次1×106cells/kg劑量、連續(xù)3次、間隔1～3 d的凍存宮血MSC輸注后，患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量升高，炎癥指標(biāo)（IL-6和C反應(yīng)蛋白）降低，肺功能改善，雙側(cè)肺滲出病灶吸收。趙春華等[37]報(bào)道，7例普通型、重型和危重型患者接受單次1×106cells/kg MSC輸注后，所有患者在治療后2 d癥狀明顯緩解。3例患者包括2例普通型和1例重型患者在治療10 d后出院。西班牙Sanchez-Guijo F等[38]報(bào)道，13例重型和危重型患者接受每次1×106cells/kg劑量、1～3次脂肪MSC輸注后呼吸狀況改善，炎癥因子水平降低。馮干珠等[39]報(bào)道，41例重型和危重型患者接受單次2×106cells/kg臍帶MSC輸注后可獲得更快的臨床改善。胡敏等[40]報(bào)道，1例重癥患者接受5×107cells/次、連續(xù)3次、間隔3 d臍帶來源MSC輸注后，炎癥指標(biāo)降低，胸部CT影像學(xué)改善。伊朗Hossein Baharvand等[41]報(bào)道，11例因COVID-19誘發(fā)ARDS的患者接受2×108cells/次、連續(xù)3次、間隔2 d臍帶或胎盤MSC輸注后呼吸窘迫癥狀緩解，炎癥因子水平降低。胡寶洋等[42-43]報(bào)道了一項(xiàng)納入27例發(fā)生肺纖維化COVID-19患者的非隨機(jī)、開放I期臨床研究，發(fā)現(xiàn)每次3×106cells/kg、1～3次人胚胎干細(xì)胞來源的基質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞（human embryonic stem cell–derived immunity-and matrix-regulatory cells,hESC-IMRCs）輸注可減輕肺纖維化程度。近期美國Camillo Ricordi等[15]報(bào)道了一項(xiàng)納入24例危重型COVID-19相關(guān)ARDS患者的隨機(jī)、對照、雙盲研究，（10±2）×107cells/次、連續(xù)2次、間隔3 d的臍帶MSC輸注能顯著改善患者存活率并縮短治療時(shí)間。王福生等[16-17]報(bào)道了臍帶MSC治療COVID-19的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究：Ⅰ期結(jié)果顯示，3×107cells/次、連續(xù)3次、每次間隔3 d的臍帶MSC輸注對9例普通型和重型患者的安全性良好；在武漢地區(qū)開展的Ⅱ期多中心前瞻性隨機(jī)雙盲安慰劑對照臨床研究中，共納入100例重型患者，結(jié)果顯示4×107cells/次、連續(xù)3次、間隔3 d的臍帶MSC輸注可有效減少重型COVID-19患者肺部損傷，改善患者活動(dòng)耐力。

上述臨床結(jié)果表明，普通型、重型、危重型的COVID-19患者接受不同來源的MSC治療后均沒有觀察到與輸注相關(guān)的不良反應(yīng)，MSC治療有助于降低患者炎癥因子水平、促進(jìn)肺部損傷修復(fù)、提高活動(dòng)耐力、縮短住院時(shí)間。

盡管已報(bào)道的多個(gè)臨床研究結(jié)果初步證實(shí)了MSC治療COVID-19的安全性和有效性，但迄今接受MSC治療的COVID-19患者數(shù)量有限，且各臨床研究的MSC劑量和療程不一。為了進(jìn)一步規(guī)范和指導(dǎo)MSC治療COVID-19的臨床實(shí)踐，提升COVID-19的治療水平，我們組織國內(nèi)前期參與COVID-19一線診療工作的專家，以及來自感染病學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、呼吸與重癥醫(yī)學(xué)、影像學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和藥理毒理學(xué)等領(lǐng)域的權(quán)威專家共同商議，形成此共識。

四、MSC治療COVID-19的建議

（一）患者的選擇

1.患者入選標(biāo)準(zhǔn)

年齡16～85歲；臨床分型為重型或危重型，分型標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[1]。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)

①既往有腫瘤病史或現(xiàn)患腫瘤者，或病理檢查證實(shí)有癌前病變者；②急性心肌梗塞活動(dòng)期或急性腦梗塞活動(dòng)期患者；③妊娠或哺乳期患者；④心理疾病病情控制不佳的患者；⑤酒精或藥物成癮者；⑥不能或不愿簽署知情同意書或依從性差者；⑦合并活動(dòng)性結(jié)核或流感病毒、腺病毒以及其它急性呼吸道病毒感染患者；⑧臨床醫(yī)生認(rèn)為不適于干細(xì)胞治療的其他患者。

（二）細(xì)胞輸注準(zhǔn)備

1.MSC的采集、制備和質(zhì)量控制

干細(xì)胞供者篩選應(yīng)建立并執(zhí)行評估標(biāo)準(zhǔn)，樣本采集必須得到供者或其法定代表人、監(jiān)護(hù)人的同意，簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；干細(xì)胞制備過程和質(zhì)量控制應(yīng)按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）要求嚴(yán)格執(zhí)行。建議在開展臨床治療項(xiàng)目前將MSC制劑送交中國食品藥品檢定研究院等行業(yè)認(rèn)可的第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核。具體規(guī)范和建議參見附件1。

2.MSC的準(zhǔn)備

凍存細(xì)胞與新鮮培養(yǎng)細(xì)胞均可用于臨床治療。凍存細(xì)胞需提前做好復(fù)蘇準(zhǔn)備。輸注前應(yīng)仔細(xì)檢查細(xì)胞袋外包裝的完整性、生產(chǎn)（凍存）日期等信息。凍存細(xì)胞輸注時(shí)首先確定好輸注時(shí)間，細(xì)胞應(yīng)在30 min內(nèi)完成復(fù)蘇、藥物配伍流程并開始輸注至患者體內(nèi)，細(xì)胞輸注應(yīng)在2 h內(nèi)完成。

3.MSC輸注方法

①推薦劑量為每次1～3×106cells/kg，每次間隔3～7 d，共進(jìn)行3次輸注。②推薦使用輸血過濾器進(jìn)行輸注，選取患者手臂較粗的靜脈血管輸注。③每袋細(xì)胞輸注前輕輕顛倒數(shù)次，使細(xì)胞懸浮均勻。④輸注前10 min緩慢靜滴（20～30 滴/ min），10～15 min后如無特殊反應(yīng)，可將滴速調(diào)整為40～50滴/ min，直至輸注完成；若患者伴有心血管疾病，則應(yīng)按醫(yī)囑控制滴速。⑤完成全部細(xì)胞輸注后，用10～30 ml生理鹽水沖洗輸注袋。⑥輸注完成后需密切觀察患者生命體征。⑦對高度過敏體質(zhì)患者建議輸注細(xì)胞前使用甲基強(qiáng)的松龍（40 mg）預(yù)防過敏反應(yīng)。

（三）細(xì)胞輸注的監(jiān)測和不良反應(yīng)處理

1.治療前準(zhǔn)備

干細(xì)胞輸注前72 h內(nèi)應(yīng)完善血常規(guī)、肝腎功能、C反應(yīng)蛋白、炎癥因子相關(guān)指標(biāo)（IL-6、IL-8、TNF-α等）、凝血功能、降鈣素原、血?dú)夥治觥⑿呐K功能、心電圖和胸部CT檢查等；詳細(xì)詢問并記錄患者既往病史、過敏史等情況。

2.治療過程監(jiān)測

應(yīng)在心電監(jiān)護(hù)和經(jīng)皮血氧飽和度監(jiān)測下進(jìn)行細(xì)胞輸注，并做好急救措施準(zhǔn)備。少數(shù)患者可能出現(xiàn)一過性的胸悶、自覺發(fā)熱等不適，一般可自行緩解。如胸悶癥狀持續(xù)，應(yīng)及時(shí)停止細(xì)胞輸注，給予吸氧和生命體征監(jiān)測，完善心電圖、血?dú)夥治龅葯z查，必要時(shí)對癥處理。

3.治療后監(jiān)測和處理

根據(jù)MSC細(xì)胞治療其他疾病的報(bào)道和治療COVID-19的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，目前其在臨床應(yīng)用中尚未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的不良事件[16，44-48]。已經(jīng)報(bào)道的安全性事件主要是細(xì)胞輸注后低熱和惡心，多為自限性，一般在24 h內(nèi)緩解。個(gè)別患者可能出現(xiàn)高熱，可給予物理降溫及對癥藥物治療。但仍不排除存在輸液反應(yīng)、過敏性休克等可能，一旦出現(xiàn)應(yīng)積極對癥治療。MSC最后一次輸注完成后3～7 d應(yīng)復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、IL-6、血?dú)夥治龊托呐K功能等，對于治療前存在明顯肺部病變患者可復(fù)查胸部CT。目前尚未發(fā)現(xiàn)與MSC細(xì)胞治療直接相關(guān)的遠(yuǎn)期不良事件，但仍建議在治療后1～2年內(nèi)定期檢查血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂、腹部彩超、胸部CT、心電圖和肺功能等。

（四）療效評價(jià)指標(biāo)

評價(jià)指標(biāo)包括：①臨床癥狀評價(jià)：氣短或呼吸困難可采用mMRC呼吸困難量表（見附件2）進(jìn)行評估，臨床綜合情況可采用WHO臨床過程綜合評分（見附件3）進(jìn)行評價(jià)[49]。②實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)：血常規(guī)、血?dú)夥治觥⒀鹾现笖?shù)（PO2/FiO2）、C反應(yīng)蛋白、炎癥因子相關(guān)指標(biāo)（IL-6、IL-8、TNF-α等）、淋巴細(xì)胞數(shù)量和亞群、乳酸脫氫酶、肝腎功能、D-二聚體、凝血功能、心肌酶等。③胸部影像學(xué)評價(jià)：建議進(jìn)行高分辨胸部CT檢查，對病變范圍和特征等進(jìn)行評估，可采用CT總嚴(yán)重程度評分（total severity score,TSS）等指標(biāo)輔助判斷[17]。④肺功能評價(jià)（出院后隨訪）：在醫(yī)療條件和患者身體狀況允許的情況下，可進(jìn)行肺功能評價(jià)[50]，主要包括限制性通氣功能障礙、肺彌散功能和氣道阻塞相關(guān)指標(biāo)。⑤臨床轉(zhuǎn)歸評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)建議參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[1]。

附件2 mMRC呼吸困難量表

附件3 WHO臨床過程綜合評分

五、實(shí)施要求

基于上述共識并結(jié)合MSC治療COVID-19的前期研究結(jié)果，為了提高COVID-19的救治效果、減少并發(fā)癥，建議在COVID-19定點(diǎn)收治醫(yī)院并按照國家有關(guān)管理辦法開展MSC治療。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)可參照《藥品管理法》和國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《藥品注冊管理辦法》，或原國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)和原國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合制定的《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》執(zhí)行。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

共識制定專家名單（以姓氏筆畫為序）：

王福生（國家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心主任，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部主任）、王貴強(qiáng)（北京大學(xué)第一醫(yī)院感染科兼肝病中心主任，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)前任主委）、王霄英（北京大學(xué)第一醫(yī)院影像科主任）、石磊（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部生物損傷救治科副主任）、劉中民（上海市東方醫(yī)院院長）、孫云霞（北京昭衍新藥研究中心股份有限公司副總經(jīng)理）、李元元（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部副主任醫(yī)師）、李太生（中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)分會(huì)主任委員，北京協(xié)和醫(yī)院感染內(nèi)科主任）、李永綱（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部副主任）、吳朝暉（中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)駐會(huì)副理事長）、吳尊友（中國疾控中心流行病學(xué)首席專家）、張文宏（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科主任，中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病分會(huì)副主委）、張宇（中源協(xié)和副總經(jīng)理兼首席科學(xué)官）、苑鑫（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科主任）、周琪（中國科學(xué)院副院長，北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院理事長，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所研究員）、孟淑芳（中國食品藥品檢定研究院生物制品研究所細(xì)胞室主任）、孟繁平（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部生物損傷救治科副主任）、項(xiàng)春生（浙江大學(xué)傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，國家干細(xì)胞臨床研究專家委員會(huì)委員）、趙春華（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系主任、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織工程研究中心主任，國家干細(xì)胞臨床研究專家委員會(huì)委員）、胡豫（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院院長）、施明（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部研究所所長）、姚晨（北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)室主任，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床研究所副所長）、徐哲（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部生物損傷救治科主任）、徐若男（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部副研究員）、高晨燕（國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心生物制品臨床部部長）、黃磊（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部感染性疾病科主任）、韓為東（中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)生物治療學(xué)專業(yè)委員會(huì)主任委員，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心腫瘤醫(yī)學(xué)部生物治療科主任）、程濤[ 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）所院長]、謝渭芬（海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院消化內(nèi)科主任醫(yī)師）、福軍亮（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部感染性疾病科副主任）、魏于全（華西醫(yī)院臨床腫瘤中心主任，生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，國家干細(xì)胞臨床研究專家委員會(huì)委員）

附件1：臍帶MSC的采集、制備與質(zhì)量控制

（一）臍帶MSC采集

臍帶MSC來源于健康胎兒的臍帶組織，產(chǎn)婦（供者）篩選應(yīng)建立并執(zhí)行評估標(biāo)準(zhǔn)，篩查供者既往病史、家族史、當(dāng)前健康報(bào)告和一般信息。既往病史和家族史要對遺傳?。▎位蚝投嗷蚣膊?，包括心血管疾病和腫瘤等）相關(guān)信息進(jìn)行詳細(xì)采集。對用于異體干細(xì)胞臨床研究的供者，必須經(jīng)過檢驗(yàn)篩選證明無人源特定病毒，包括艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人類嗜T 細(xì)胞病毒（HTLV）、EB 病毒（EBV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）等的感染，以及無梅毒螺旋體感染。必要時(shí)需要收集供者的ABO 血型、HLA-I和II類分型資料，以備追溯性查詢。此外必要時(shí)還應(yīng)提供供者出入疫區(qū)等其他情況的報(bào)告并進(jìn)行相關(guān)樣本檢測。樣本采集必須得到供者或其法定代表人、監(jiān)護(hù)人的同意，簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。樣本的接收、轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，并做好標(biāo)識和記錄。

（二）臍帶MSC制備

1.制備環(huán)境及工藝流程設(shè)置

應(yīng)制定干細(xì)胞采集、分離和干細(xì)胞庫建立的標(biāo)準(zhǔn)操作及管理規(guī)程，并在符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）要求的基礎(chǔ)上嚴(yán)格執(zhí)行，制備過程必須在B級潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，嚴(yán)格無菌操作。非完全密封狀態(tài)下的細(xì)胞操作（如分離、培養(yǎng)、灌裝等）以及與細(xì)胞直接接觸的無法終端滅菌的試劑和器具的操作，應(yīng)在B級背景下的A級環(huán)境中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)操作程序應(yīng)包括：操作人員培訓(xùn)；材料、儀器、設(shè)備的使用和管理；干細(xì)胞的采集、分離、純化、擴(kuò)增和細(xì)胞（系）的建立；細(xì)胞保存、運(yùn)輸及相關(guān)保障措施，以及清潔環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)及常規(guī)維護(hù)和檢測等。

為盡量減少不同批次細(xì)胞在研究過程中的變異性，可在工藝流程中建立種子庫（master cell bank）和工作細(xì)胞庫（working cell bank）等多級管理體系，其中種子庫一般建議建立在P2代，工作細(xì)胞庫一般建議建立在P4～P5代，同時(shí)可在不同級的細(xì)胞庫中設(shè)置不同的細(xì)胞基本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在細(xì)胞采集、分離及細(xì)胞（系）建立階段（如種子庫），重點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞鑒別、成活率及生長活性（包括細(xì)胞倍增時(shí)間、細(xì)胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等）、外源致病微生物，以及基本的干細(xì)胞特性檢測（包括特定表面標(biāo)志物群，成脂、成骨和成軟骨的分化潛能等）。而對經(jīng)過復(fù)雜的體外培養(yǎng)和操作后的準(zhǔn)備用于臨床前及臨床研究的細(xì)胞庫（如工作細(xì)胞庫）中的細(xì)胞，除進(jìn)行上述檢測外，還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行全面的內(nèi)外源致病微生物和詳細(xì)的干細(xì)胞特性檢測（包括干細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物、分泌的功能因子以及免疫學(xué)調(diào)控功能等），以及細(xì)胞純度分析。

2.關(guān)鍵原輔料控制

體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，需要注意定期更換培養(yǎng)液，及時(shí)傳代。生產(chǎn)制備過程中使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)過程的添加物等重要原材料和輔料盡量使用經(jīng)監(jiān)管當(dāng)局批準(zhǔn)的產(chǎn)品（如藥用輔料等），否則建議使用高質(zhì)量級別的產(chǎn)品。特別是培養(yǎng)基成分，在滿足干細(xì)胞正常生長的情況下，應(yīng)符合無菌、無致病微生物及內(nèi)毒素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，殘留的培養(yǎng)基對受者應(yīng)無不良影響；且不影響干細(xì)胞的生物學(xué)活性，即干細(xì)胞的“干性”及分化能力。在干細(xì)胞制劑制備過程中，應(yīng)盡量避免使用抗生素。若使用商業(yè)來源的培養(yǎng)基，應(yīng)當(dāng)選擇有資質(zhì)的生產(chǎn)商并由其提供培養(yǎng)基的組成成分及相關(guān)質(zhì)量合格證明。必要時(shí)，應(yīng)對每批培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。除特殊情況外，應(yīng)盡可能避免在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用人源或動(dòng)物源性血清，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動(dòng)物血清，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)檢測以確保其無特定動(dòng)物源性病毒污染，不使用海綿體狀腦病等傳染病流行區(qū)來源的牛血清。若培養(yǎng)基中含有人的血液成分，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和各種細(xì)胞因子等，應(yīng)盡量采用國家已批準(zhǔn)的可臨床應(yīng)用或GMP級的產(chǎn)品，同時(shí)應(yīng)明確其來源及批號，并要求提供質(zhì)量檢定合格報(bào)告。

3.制備工藝研究與控制

MSC制劑的制備工藝包括干細(xì)胞的采集、分離、純化、擴(kuò)增和傳代，干細(xì)胞庫的建立、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、分裝和標(biāo)記以及殘余物去除，并建立培養(yǎng)基、輔料和包材的選擇標(biāo)準(zhǔn)。建議根據(jù)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design,QbD）的原則對制劑制備的全過程，包括細(xì)胞收獲、傳代、分裝等操作，進(jìn)行全面的工藝研究和驗(yàn)證，制定合適的工藝參數(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保對每一過程的有效控制。從整個(gè)工藝制備流程到輸入到受試者體內(nèi)全過程，需要追蹤觀察并詳細(xì)記錄。對不合格并需要丟棄的干細(xì)胞制劑，需對丟棄過程進(jìn)行規(guī)范管理和記錄。對于剩余的干細(xì)胞制劑的處理必須合法合規(guī)并符合倫理要求，應(yīng)制定相關(guān)的操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。干細(xì)胞制劑的相關(guān)資料需建檔并長期保存。制備的干細(xì)胞制劑可按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行儲存、解凍復(fù)蘇。新鮮使用的細(xì)胞制劑只能在4～12 ℃短時(shí)間保存，建議在12 h內(nèi)（具體新鮮制劑保存時(shí)間和有效期應(yīng)通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定）進(jìn)行干細(xì)胞移植。液氮凍存的制劑建議進(jìn)行長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以明確有效性、運(yùn)輸和使用條件等，復(fù)蘇后盡量在30 min內(nèi)進(jìn)行回輸。

（三）臍帶MSC質(zhì)量控制

由于干細(xì)胞制劑制備的最后過程往往無法進(jìn)行過濾等除菌操作，因而過程和質(zhì)量控制顯得尤為重要。為確保制劑的質(zhì)量及其可控性，干細(xì)胞制劑的檢驗(yàn)可分為質(zhì)量檢驗(yàn)和放行檢驗(yàn)。質(zhì)量檢驗(yàn)是為保證干細(xì)胞經(jīng)特定體外處理后的安全性、有效性和質(zhì)量可控性而進(jìn)行的較全面質(zhì)量檢驗(yàn)，檢測方法需要根據(jù)2020版《中國藥典》的規(guī)定進(jìn)行驗(yàn)證后施行，如為自主建立的新檢測方法需進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證后施行。放行檢驗(yàn)是在完成質(zhì)量檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對每一類型的每一批次干細(xì)胞制劑，在臨床應(yīng)用前所應(yīng)進(jìn)行的檢驗(yàn)。建議對多批次干細(xì)胞制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，并在制備工藝、場地或規(guī)模等發(fā)生變化時(shí)，重新對制備過程進(jìn)行工藝驗(yàn)證?？山⒖焖俜判袡z驗(yàn)方法來確認(rèn)細(xì)胞制劑的質(zhì)量及安全信息，以保證臨床使用的及時(shí)性。

干細(xì)胞制劑抵達(dá)醫(yī)療機(jī)構(gòu)后，建議輸注前可通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測定對干細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，有條件的機(jī)構(gòu)可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞表型的鑒定。

1.制劑放行檢驗(yàn)指標(biāo)（表1）

表1 制劑放行檢驗(yàn)指標(biāo)及制定依據(jù)

2.制劑醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測項(xiàng)目

指醫(yī)療機(jī)構(gòu)對運(yùn)抵醫(yī)院的細(xì)胞制劑進(jìn)行的檢驗(yàn)以進(jìn)一步檢測輸注前細(xì)胞的狀態(tài)。至少應(yīng)包括細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率檢測，有條件的可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞表型的鑒定和細(xì)胞凋亡檢測。

3.第三方機(jī)構(gòu)檢測

制備的MSC制劑建議臨床治療前送交中國食品藥品檢定研究院等權(quán)威第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢定，以進(jìn)一步明確其相關(guān)產(chǎn)品屬性。

4.制劑的質(zhì)量研究建議在臨床前研究階段，利用不同的體外和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方法對干細(xì)胞制劑進(jìn)行全面的安全性、有效性及穩(wěn)定性研究。安全性研究主要包括：（1）生長活性和狀態(tài)。生長因子依賴性的檢測，在培養(yǎng)生長因子依賴性的干細(xì)胞時(shí)，需對細(xì)胞生長行為進(jìn)行連續(xù)檢測，以判斷不同代次的細(xì)胞對生長因子的依賴性。（2）致瘤性和促瘤性。目前，普遍認(rèn)為MSC“不致瘤”或具有“弱致瘤性”，但不排除其對已存在腫瘤的“促瘤性”作用。因此建議在動(dòng)物致瘤性試驗(yàn)中，選擇足夠數(shù)量的細(xì)胞和足夠長的觀察期。另一方面，除嚙齒類動(dòng)物外可選擇食蟹猴等大動(dòng)物模型以明確長期安全性。（3）加強(qiáng)對培養(yǎng)過程中添加的成分殘余量的檢測，以控制殘余的、影響干細(xì)胞制劑質(zhì)量和安全性的成分，如牛血清蛋白、抗生素、外源細(xì)胞因子。有效性指標(biāo)主要包括其生物學(xué)效應(yīng)。隨著研究的進(jìn)展，建議針對臨床治療的適應(yīng)癥和其治療機(jī)理，不斷研究并更新生物學(xué)效應(yīng)檢測方法以找到替代性生物標(biāo)志物。穩(wěn)定性研究主要包括對干細(xì)胞制劑在儲存（如一般生物制品運(yùn)輸溫度，或液氮凍存和細(xì)胞植入前的臨時(shí)存放）和運(yùn)輸過程中開展的一系列穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以確定制劑的有效期。檢測項(xiàng)目主要包括細(xì)胞活性、密度、純度、無菌性等。根據(jù)干細(xì)胞制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，確定其制劑的保存液成分與配方、保存及運(yùn)輸條件以及有效期，同時(shí)確定與有效期相適應(yīng)的運(yùn)輸容器和工具，以及合格的細(xì)胞凍存設(shè)施和條件。

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