饒晶，朱四元，嚴理，劉頭明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）通常是指不具有編碼蛋白質(zhì)的功能、長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，在各種生物中廣泛存在［1］。lncRNAs大致可分為5大類：基因間里lncRNA（lincRNAs）；內(nèi)含子的lncRNA（incRNAs）；雙向 lncRNAs；從相關(guān)基因的 DNA互補鏈轉(zhuǎn)錄的自然反義轉(zhuǎn)錄物（NATs）；與同義鏈上另一轉(zhuǎn)錄物的一個或多個外顯子重疊的同義lncRNAs［2］。lncRNA的作用機制和生物學(xué)功能極其多樣，一些通過目標(biāo)模仿、轉(zhuǎn)錄干擾、與多梳蛋白抑制復(fù)合體2（Polycomb repressive complex 2，PRC2）有關(guān)的組蛋白甲基化和DNA甲基化等機制介導(dǎo)基因表達。lncRNA生物學(xué)功能豐富，在生物體內(nèi)以多種方式調(diào)節(jié)生物過程，比如在植物開花、雄性不育、營養(yǎng)代謝、生物和非生物脅迫等生物過程中起調(diào)節(jié)因子作用［3］。lncRNA的作用機制主要有4種：信號分子、誘餌分子、引導(dǎo)分子、支架分子［4］。以擬南芥、水稻、玉米和小麥等植物生物及一些成熟動物中l(wèi)ncRNA的分子研究作為參考，進一步研究非模式生物lncRNA的作用機制［5-6］。

苧麻（BoehmerianiveaL.）是世界上最古老的纖維作物之一，在中國已經(jīng)種植了幾千年［7］。作為我國南方重要的經(jīng)濟作物之一［8］，苧麻纖維是一種纖維素含量極高的天然纖維，具有很高的彈性和耐磨性，被稱為“天然纖維之王”。與棉花和楊樹的纖維不同，從莖皮中提取的苧麻纖維是韌皮組織。苧麻纖維形成于莖皮中，其生長發(fā)育決定了苧麻莖皮厚度［9］。苧麻纖維具有許多優(yōu)良的特性和重要的經(jīng)濟價值，其長度可達55 cm，在植物界是罕見的［10］。植物次生細胞壁（Secondary cellwall，SCWs）包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物合成。在本研究中，為了了解苧麻纖維形成的調(diào)控規(guī)律，測序鑒定可能參與SCWs生物合成的lncRNA，結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）鑒定lncRNA在苧麻不同部位的表達量差異，旨在為苧麻纖維發(fā)育研究及品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苧麻材料為栽培種苧麻中苧1號，是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所培育的高產(chǎn)品種。所取材料經(jīng)自來水和蒸餾水洗凈后，將成熟期苧麻莖、頂皮、中皮、葉、根、芽用液氮迅速冷凍，保藏于-80℃超低溫冰箱，用作RNA提取的材料。

1.2 主要試劑

植物RNA提取試劑盒 （Takara）、cDNA合成試劑盒（Takara）、熒光定量PCR試劑盒 （Takara），其他生化試劑均購自寶生物工程有限公司。

1.3 lncRNA的篩選

選取苧麻頂皮、中皮兩個部位，3個重復(fù)，利用Illumina測序平臺（HiSeq2500）對苧麻轉(zhuǎn)錄組進行測序，使用HISAT軟件將轉(zhuǎn)錄組測序clean reads與苧麻基因組（accession ID：PHNS00000000）進行比對［11］，使用StringTie程序［12］進行轉(zhuǎn)錄的組裝，使用cufflinks比較程序［13］將所有轉(zhuǎn)錄本的基因組位置與參考基因組注釋的已知基因進行比較［14］。使用4種方法檢測轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)編碼潛力，包括與PFAM數(shù)據(jù)庫比對、利用CPC軟件［15］、txCdsPredict和CNCI［16］進行預(yù)測。4種預(yù)測方法中至少有3種報告為lncRNA的轉(zhuǎn)錄本被鑒定為lncRNA，而lncRNA是通過cis-or trans-way靶向mRNA實現(xiàn)其功能［17］。通過估計Spearman相關(guān)系數(shù)和Pearson相關(guān)系數(shù)，僅考慮spearman_cor≥0.6和pearson_cor≥0.6進行后續(xù)分析。如果定位在一個10 kb區(qū)域，則認為lncRNA通過順式調(diào)控靶向；如果沒有則使用RNAplex軟件分析反式作用靶標(biāo)［18］，參數(shù)為-e-30。

1.4 總RNA提取和cDNA第一條鏈合成

取約50 mg的組織樣，置于液氮中研磨之后，用試劑盒法（Takara公司）提取總RNA。用超微量紫外分光光度計檢測其濃度和OD值，根據(jù)超微量分光光度計定量，OD260 nm/OD280 nm值均在1.8～2.0，說明提取的總RNA純度較高，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，繼而反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）說明書將總RNA（1μg）反轉(zhuǎn)成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫。20μL體系，反應(yīng)條件：30°C 10 min，42°C 20 min，95°C 5min，反轉(zhuǎn)錄完成后再加無菌水稀釋5倍成100μL，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-80°C冰箱保存。

1.5 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中中苧1號基因序列，采用Premier 5.00軟件設(shè)計特異性引物，以苧麻18s基因作為內(nèi)參基因，由擎科生物有限公司設(shè)計合成實時熒光定量PCR引物，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物列表Table 1 List of qRT-PCR primers

1.6 實時熒光定量PCR驗證

采用SYBRGreen熒光染料法在實時熒光定量PCR儀上進行定量。反應(yīng)體系（25μL）：TB GreenPremix Ex TaqII 12.5μL，cDNA 2μL，無菌水8.5μL，上、下游引物各 1μL。反應(yīng)條件：95°C 30 s，95°C 5 s，60°C 30 s，40個循環(huán)后進行熔解曲線分析，以每5秒上升0.5°C的速率從65°C升高到95°C，熒光信號在循環(huán)結(jié)束時檢測，每個樣品做3個重復(fù)，擴增結(jié)束后進行溶解曲線分析。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel進行統(tǒng)計和分析，相對表達量的計算以18s為內(nèi)參基因，計算Ct值（Ct代表目標(biāo)擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），通過計算ΔC（ΔC＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參），然后獲得ΔΔC（ΔΔC＝ΔC（實驗組）-ΔC（對照組），得到RQ值（RQ＝2-ΔΔC）（表達量變化倍數(shù)，RQ值）。用Ct值3次重復(fù)的平均值作為該基因在該處理組的表達量，并計算RQ的誤差［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA鑒定

轉(zhuǎn)錄本編碼能力預(yù)測如圖1，通過CPC、CNCI、txCdsPredict 3個軟件和PFAM數(shù)據(jù)庫比對，4種預(yù)測方法中至少有3種報告為lncRNA的轉(zhuǎn)錄本被鑒定為lncRNA，共得到4316個lncRNA。測序得到可能參與SCW生物合成的8個靶基因，進一步分析靶基因的功能注釋如表2，whole_GLEAN_10005546、whole_GLEAN_10005548、whole_GLEAN_10025325、whole_GLEAN_10016451 4個基因?qū)倥c擬南芥MYB（v-mybavianmyloblastosisviraloncogenehomolog）蛋白，whole_GLEAN_10012500屬于擬南芥NAC（NAM，ATAF1/2和CUC2）蛋白，whole_GLEAN_10022328屬于擬南芥BLH（Bel like homeodomain 1）蛋白，whole_GLEAN_10020282屬于擬南芥LOB（Lateralorganboundaries）蛋白，whole_GLEAN_10008444屬于擬南芥IRX（Irregularxylem）蛋白。8個靶基因均為擬南芥纖維發(fā)育同源基因，這些靶基因被lncRNA主要以cis、Lnc-AntiOverlap-mRNA、trans和Lnc-Overlap-mRNA 4種靶向方式調(diào)控。再根據(jù)8個靶基因選出靶向調(diào)控他們的10個lncRNAs做進一步結(jié)構(gòu)分析。由表3可知，10個候選基因有1～2個外顯子；轉(zhuǎn)錄本長度最短的為239 bp，最長的為1401 bp。

圖1 預(yù)測結(jié)果韋恩圖-lncRNAFig.1 Predicted results：Venn graph-lncRNA

表2 lncRNA靶基因的功能注釋Table 2 Functional annotation of target genes of lncRNA

表3 lncRNA結(jié)構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果Table 3 Statistical results of lncRNA structure

2.2 熒光定量PCR擴增曲線和熔解曲線分析

為了檢測擴增產(chǎn)物的特異性，避免qRT-PCR擴增過程中非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號造成假陽性結(jié)果［20-21］，本文對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析［22］。由圖2可知，18s基因和10個候選基因在中苧1號不同器官中的擴增產(chǎn)物熔解曲線為單一的峰，無非特異性擴增產(chǎn)物及引物二聚體產(chǎn)生，說明設(shè)計的引物符合試驗要求，擴增體系、退火溫度及循環(huán)程序均適合。

圖2 18s和10個候選基因的溶解曲線分析Fig.2 Dissolution curve analysis of 10 candidate genes and 18s

2.3 lncRNA表達差異分析

理想的內(nèi)參基因應(yīng)具備下列特性：在所有組織和細胞類型中表達、在所有的環(huán)境和試驗條件下穩(wěn)定表達、具有與目標(biāo)基因相似的穩(wěn)定表達水平［23］。本研究利用苧麻18s基因作為內(nèi)參，該基因在苧麻莖、頂皮、中皮、葉、根、芽6個部位都可以表達。從表4來看，該基因在不同部位標(biāo)準誤較?。?.109～0.537），變異率（C.V）也較?。?.056～6.254）。因此 18s基因可以作為內(nèi)參進行苧麻RT-qPCR相對定量分析研究。

表4 內(nèi)參基因18s在不同部位中的表達穩(wěn)定性Table 4 The expression stability of reference gene 18s in different sites

采用表達量變化倍數(shù)（RQ值）對10個lncRNA基因在中苧1號苧麻品種中不同器官間的表達情況進行分析。以中苧1號頂皮的表達作為對照，設(shè)定表達量為1。由圖3可知，LTCONS_00012428在莖中表達量約為頂皮部位中的42倍，LTCONS_00022274在莖中表達量約為頂皮部位中的29倍，LTCONS_00034183在莖中表達量約為頂皮部位中的7倍，這3個基因在中苧1號不同部位間的表達量不同，在莖中的表達量最高，而在其他部位的表達則較少。LTCONS_00012431在中苧1號不同部位的表達量不同，在葉中的表達量最高，約為頂皮部位中的10倍，芽次之，表達量約為頂皮部位中的9倍，在莖與中皮中也有差異表達，而在根中表達則較少。LTCONS_00034274在芽中表達量約為頂皮部位中的18倍，LTCONS_00002219在芽中表達量約為頂皮部位中的1.2倍，LTCONS_00050912在芽中表達量約為頂皮部位中的19倍，LTCONS_00019019在芽中表達量約為頂皮部位中的21倍，這4個基因在中苧1號不同部位間的表達量不同，在芽中的表達量最高，而在其他部位的表達相對較少。LTCONS_00043847在中苧1號不同部位的表達量不同，在頂皮部位表達量最高為1，芽次之，約為頂皮部位的0.7倍，而在其他部位的表達則較少。LTCONS_00034273在莖中表達量高達頂皮部位中的3100倍?？傊麄冊诓煌课坏谋磉_量差異明顯。

圖3 10個lncRNA在不同部位的差異表達分析Fig.3 Analysis of differential expression of 10 lncRNAs in different positions

2.4 纖維發(fā)育相關(guān)lncRNA鑒定

由于頂皮與中皮纖維發(fā)育差異明顯，中皮纖維處于生長期，次生壁正在加厚，而頂皮纖維尚未起始生長，若兩個部位有差異表達則認為可能與纖維發(fā)育有關(guān)。根據(jù)頂皮與中皮纖維發(fā)育差異特征，將10個lncRNA在頂皮、中皮兩個部位進行熒光定量分析，如圖3所示，9個lncRNA在兩個部位表現(xiàn)出明顯差異，推測他們與苧麻纖維發(fā)育相關(guān)。1個lncRNA在兩個部位表現(xiàn)差異較小，推測他們與苧麻纖維發(fā)育無關(guān)，具體表述如下：LTCONS_00012428在頂皮表達量是中皮的21.2倍；LTCONS_00022274在頂皮表達量是中皮的2.2倍；LTCONS_00034183在頂皮表達量是中皮的3.8倍；LTCONS_00034274在頂皮表達量是中皮的31.5倍；LTCONS_00043847在頂皮表達量是中皮的48.3倍；LTCONS_00050912在頂皮表達量是中皮的92.8倍；LTCONS_00034273僅在頂皮中有表達；LTCONS_00002219在頂皮表達量是中皮的172.3倍；LTCONS_00019019在頂皮表達量是中皮的8.8倍；LTCONS_00012431在頂皮表達量是中皮的0.8倍?？梢钥闯鯨TCONS_00012431在這兩個部位差異不明顯，推測其與苧麻纖維發(fā)育不相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

lncRNA以多種方式參與基因的表達調(diào)控，在其效應(yīng)過程中也可能涉及蛋白質(zhì)、DNA或 RNA等多種相關(guān)因子［24］。現(xiàn)在研究廣泛認為lncRNA能在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，從而調(diào)控生物的生長發(fā)育［25］。植物lncRNA的研究目前已在擬南芥、蒺藜苜蓿、水稻和玉米中進行了全基因組lncRNA的檢索及相關(guān)研究［26-27］，其他物種的lncRNA研究表明其在生物體內(nèi)起著重要的作用。本文首次從苧麻中測序得到4316個lncRNA，從4316個lncRNA選取10個lncRNA做表達譜分析，發(fā)現(xiàn)其中3個lncRNA在莖中的表達量最高，其原因可能是苧麻莖中纖維含量豐富；而1個基因在芽表達量最高，可能是該基因在該部位含量較豐富導(dǎo)致；5個基因在葉表達量最高，可能與苧麻葉中的纖維含量有關(guān)；1個基因在頂皮的表達量最高，在其他部位的表達則較少，試驗中苧麻頂皮纖維尚未起始生長，可能由于該基因在該部位含量較豐富導(dǎo)致?？傊?，10個候選基因中大多數(shù)基因集中在葉、莖部位表達，少數(shù)基因集中在頂皮、芽部位表達。進一步研究其與纖維發(fā)育的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其中9個基因在頂皮、中皮兩個部位差異表達明顯，推測其可能與纖維發(fā)育相關(guān)。而靶基因測序得到10個lncRNA所對應(yīng)的8個靶基因是擬南芥纖維發(fā)育基因同源基因，大部分屬于MYB、NAC等蛋白，在擬南芥中，目前認為SCW主要是由一系列NAC轉(zhuǎn)錄因子和MYB轉(zhuǎn)錄因子形成分層次的網(wǎng)絡(luò)逐級調(diào)控下游次生壁中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的合成［28］。在擬南芥纖維發(fā)育調(diào)控中，NAC基因主要調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子再逐級調(diào)控完成整個SCW的生物合成過程。文獻［29］報道LOB（lateralor-ganboundaries）基因通過與轉(zhuǎn)錄因子、激素等作用參與擬南芥SCW的形成。而擬南芥基因IRX15（IRREGULAR XYLEM 15）對于正常木聚糖在次級細胞壁中的沉積至關(guān)重要［30］。擬南芥BLH1（BEL1-like homeodomain）基因通過與蛋白質(zhì)的相互作用調(diào)節(jié)擬南芥從營養(yǎng)期到生殖期，從而參與纖維發(fā)育［31］。故而推測差異lncRNA基因主要通過靶向他們各自的靶基因從而調(diào)控纖維的發(fā)育。