謝 云 郭芳蕓 陳麗華 曹 兵

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021)

據(jù)IPCC報(bào)告(趙宗慈等， 2018)，2011年達(dá)到390.5 μmol·mol-1，設(shè)在美國(guó)夏威夷莫納羅阿島上的測(cè)量站測(cè)得的數(shù)據(jù)顯示(Wangetal.， 2019)，2018年5月大氣中CO2濃度達(dá)到415 μmol·mol-1。大氣 CO2濃度升高已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。CO2濃度升高主要通過(guò)影響植物的生長(zhǎng)進(jìn)而間接影響土壤微生物的群落和結(jié)構(gòu)，會(huì)引起植物-土壤-微生物群落以及整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)的功能性改變(Rieretal.， 2005;Delgado-Baquerizoetal.， 2017)。

土壤是自然界物質(zhì)循環(huán)的重要基地，而土壤微生物是土壤的重要組成之一(Muelleretal.， 2018)。土壤微生物多樣性在維持多種生態(tài)系統(tǒng)功能方面起著重要作用，如固氮作用、硝化反硝化作用、腐殖質(zhì)分解和合成作用以及養(yǎng)分循環(huán)和對(duì)溫室氣體排放的調(diào)節(jié)作用(McFarlandetal.， 2013； Williamsetal.，2000； 徐國(guó)強(qiáng)等， 2002)。因此，了解土壤微生物多樣性及其活動(dòng)狀況具有重要意義，但是目前有關(guān)土壤微生物群落在全球氣候變化環(huán)境背景下的驅(qū)動(dòng)因素、變化規(guī)律和機(jī)制尚需深入研究。

大氣-植物相互影響方面已有諸多研究，如高CO2濃度對(duì)水稻(Oryzastiva)(Terrer, 2018)、黑麥草(Loliumperenne)(馬紅亮等， 2010)等的光合碳分配產(chǎn)生影響，從而使植物葉片中碳的增幅最顯著，其次為根、莖； 但對(duì)地下以及與地上部分之間的耦合關(guān)系的研究少有報(bào)道，特別是微生物主導(dǎo)的碳氮循環(huán)過(guò)程對(duì)全球氣候變化的反饋機(jī)制仍是研究的難點(diǎn)之一。大氣CO2濃度升高對(duì)于草本植物土壤微生物群落影響的研究較多((Dijkstraetal.， 2011； Rilligetal.， 1998； 王立， 2006)，而對(duì)于木本植物土壤微生物群落及功能多樣性的研究較為缺乏。

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬多年生落葉灌木(牛燕，2005)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、藥理作用明顯的特點(diǎn)，是典型的藥食同源植物(劉賽等， 2019)，在寧夏、甘肅、山西、內(nèi)蒙古、山西、河北等地均有分布和栽培(徐常青等， 2014； 馬海軍等， 2015)， 其中以‘寧杞1號(hào)’品種栽培面積最大。前期研究發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高對(duì)寧夏枸杞果實(shí)糖類、代謝產(chǎn)物及調(diào)控糖代謝基因產(chǎn)生影響，總糖、類胡蘿卜素含量顯著下降，黃酮含量顯著升高，糖代謝基因顯著上調(diào)，表明CO2濃度升高對(duì)寧夏枸杞生理代謝產(chǎn)生顯著影響(Maetal.， 2019; 哈蓉等， 2019)。目前對(duì)寧夏枸杞根際微生物功能調(diào)控方面未有報(bào)道。本研究利用BIO-ECO生態(tài)板技術(shù)(Zhangetal.， 2014)對(duì)不同CO2濃度的寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落以及土壤微生物對(duì)不同碳源的代謝能力進(jìn)行研究與分析，旨在揭示隨著CO2濃度的增加，不同時(shí)期寧夏枸杞土壤微生物對(duì)碳源的利用特性以及土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為揭示枸杞栽培土壤微生物群落對(duì)氣候變化的響應(yīng)提供參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019年3—10月在寧夏大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，供試材料為寧夏枸杞‘寧杞1號(hào)’1年生扦插苗。

本試驗(yàn)為單因素設(shè)計(jì)，設(shè)置自然環(huán)境大氣CO2濃度[CK，(400±20) μmol·mol-1]、0.5倍增大氣CO2濃度[TR1，(600±20) μmol·mol-1]、1倍增大氣CO2濃度[TR2，(800±20) μmol·mol-1]3個(gè)處理，每處理設(shè)3次重復(fù)，采用開(kāi)頂氣室(open-top chamber，OTC)來(lái)控制模擬CO2濃度水平(馬亞平等， 2019)，共9個(gè)氣室，每氣室種植9株‘寧杞1號(hào)’扦插苗。自2019年5月起，對(duì)氣室進(jìn)行CO2通氣處理(每日8： 00—20： 00，共12 h)(郭芳蕓等， 2019)。

1.2 土壤樣品采集 CO2通氣處理后30，60，90，120天在各氣室內(nèi)采用五點(diǎn)取樣法取0～40 cm土樣，48 h內(nèi)進(jìn)行BIOLOG功能多樣性分析，試驗(yàn)處理前取樣測(cè)定做樣地土壤理化性質(zhì)分析(表1)。

表1 各樣地土壤基本理化性質(zhì)①Tab.1 Soil physical and chemical properties of samples

1.3 土壤微生物功能多樣性測(cè)定 BLO-ECO微平板接種方法(曹宏杰等， 2019)，將接種好的微平板置于25 ℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，每隔12 h用酶標(biāo)儀讀取590 nm下的吸光度，連續(xù)測(cè)定7天。

微生物整體活性指標(biāo)采用微平板每孔顏色平均變化率(average well color development，AWCD)來(lái)描述(鄧嬌嬌等， 2018)，Shannon，Simpson，McIntosh等多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下：

平均吸光度AWCD：

AWCD=∑(Ai-AA1)/31。

式中：Ai為第i孔的吸光值，AA1為A1孔的吸光值，Ai-AA1為負(fù)值時(shí)則歸0。

Shannon指數(shù)H′：

H′=-∑Pi×ln(Pi) ；

Simpson指數(shù)D：

式中：Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率。

McIntosh指數(shù)U：

式中：ni為第i孔的相對(duì)吸光值。

McIntosh均一度E：

式中：N為相對(duì)吸光值的總和，S為發(fā)生顏色變化的孔的數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與整理，數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用Origin2018進(jìn)行主成分分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物 AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig. 1 Changes of soil microorganism AWCD in root zone of wolfberry under elevated CO2 with culture time A:處理30天時(shí)AWCD值變化AWCD value change of treatment for 30 d； B: 處理60天時(shí)AWCD值變化AWCD value change of treatment for 60 d； C: 處理90天時(shí)AWCD值變化AWCD value change of treatment for 90 d； D: 處理120天時(shí)AWCD值變化AWCD value change of treatment for 120 d.

2.1 大氣CO2濃度升高對(duì)寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落代謝活性的影響 BIO-ECO生態(tài)板的平均顏色變化率(average well color development，AWCD)是指通過(guò)土壤微生物對(duì)碳源的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶與顯色物質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)變化來(lái)表現(xiàn)出土壤微生物群落的整體活性，也表示對(duì)各種碳源的整體利用情況(黨雯等， 2015)。由圖1可知，AWCD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加迅速升高，生長(zhǎng)趨勢(shì)呈“S型”增長(zhǎng)，表明土壤微生物在不斷利用碳源，直到培養(yǎng)至144 h 后變化趨于平緩，說(shuō)明寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落在36～144 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)代謝活性最強(qiáng)。不同CO2濃度處理之間土壤微生物活性具有差異，土壤微生物群落代謝活性變化的總趨勢(shì)為： 自然環(huán)境大氣CO2濃度<0.5倍增CO2濃度<1倍增CO2濃度，說(shuō)明在3個(gè)處理中1倍增CO2濃度處理下的土壤微生物群落具有最強(qiáng)的代謝能力。

由圖2可知，在CO2通氣處理30、60、90、120天時(shí)，AWCD的曲線高度從自然環(huán)境CO2濃度、0.5倍增CO2濃度、1倍增CO2濃度依次升高，且呈遞增趨勢(shì)。其中處理60天時(shí)的AWCD值均為最高，表明其對(duì)碳源的利用量最多，微生物代謝活性最強(qiáng)，處理90天時(shí)次之； 而處理120天時(shí)寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物代謝活性最弱。寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落在7月(處理60天)活性最強(qiáng)，9月(處理120天)活性最弱。

圖2 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤 微生物的活性隨處理時(shí)間的變化Fig. 2 Changes of soil microbial activity in the root zone of wolfberry under the treatment of elevated CO2 with treatment time

2.2 大氣CO2濃度升高對(duì)寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響 多樣性指數(shù)越大則表明，土壤微生物群落多樣性越高(王超群等， 2019)。由表2可知，不同CO2濃度處理之間土壤微生物群落代謝活性差異顯著，對(duì)碳源利用能力的順序?yàn)?倍增大氣CO2濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度； 而土壤微生物物種豐富度Shannon 指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度Simpson指數(shù)均為1倍增濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度，但是1倍增和0.5倍增大氣CO2濃度處理之間無(wú)顯著差異，但均顯著高于對(duì)照。McIntosh 指數(shù)為1倍增濃度>0.5倍增濃度>自然環(huán)境濃度，0.5倍增相比于1倍增CO2濃度差異不顯著。以上結(jié)果表明，1倍增CO2濃度寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落多樣性顯著高于自然環(huán)境CO2濃度。

根據(jù)處理時(shí)間的差異來(lái)看，寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落均勻度指數(shù)McIntosh變化趨勢(shì)與物種豐富度指數(shù)Shannon相似，整體呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì)。處理60天和90天時(shí)McIntosh 指數(shù)最高，處理120天時(shí) McIntosh 指數(shù)最低，Simpson指數(shù)除處理60天時(shí)無(wú)顯著差異，其他時(shí)間段均有顯著差異。

2.3 大氣CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落碳代謝指紋圖譜分析 BIO-ECO微平板共具有31種碳源，其中主要分為單糖、糖苷、聚合糖等糖類，氨基酸類，酯類，醇類，胺類以及酸類6大類(錢明媚，2015)。根據(jù)不同CO2濃度處理的寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對(duì)6大類碳源的利用程度進(jìn)行分析，由圖3可知，土壤微生物利用率較大的碳源主要為氨基酸類、酯類和胺類，而糖類和酸類利用率較低，說(shuō)明氨基酸類、酯類和胺類是寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落利用并轉(zhuǎn)化的主要碳源。

AWCD>1.5的碳源，自然環(huán)境大氣CO2濃度處理有12種碳源，占總碳源數(shù)的38%； 0.5倍增CO2濃度處理有11種，占總碳源數(shù)的35.48%； 而1倍增CO2濃度則具有17種，占總碳源數(shù)的54.84%，說(shuō)明大氣CO2濃度升高土壤微生物群落對(duì)于碳源的利用類型增多。不同大氣CO2濃度處理下土壤微生物群落對(duì)L-天冬酰胺酸、D-甘露醇、L-絲氨酸、L-天冬酰胺酸、乙基胺、4-羥基苯甲酸和吐溫-40的利用強(qiáng)度較大。1倍增大氣CO2濃度處理下，土壤微生物群落對(duì)L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、吐溫-40、苯乙基胺和4-羥基苯甲酸等的利用代謝能力顯著高于對(duì)照，而自然環(huán)境大氣CO2濃度下土壤微生物群落對(duì)于γ-羥基丁酸的利用代謝能力顯著高于CO2升高的處理。

表2 CO2濃度升高下土壤微生物功能多樣性指數(shù)Tab.2 Functional diversity index of soil microbes under elevated CO2

2.4 大氣CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落代謝多樣性類型主成分分析 在BIO-ECO生態(tài)板中，碳源在主成分上的載荷值越高，則表示該種碳源對(duì)主成分的影響越大。如表3所示，對(duì)主成分1( PC1) 貢獻(xiàn)率大的碳源10種，其中，糖類1種，氨基酸類2種，酯類2種，醇類1種，酸類3種，與 PC1正相關(guān)程度最高的碳源為D-氨基葡萄糖酸(0.238)，L-苯基丙氨酸(0.237)次之。對(duì)主成分2( PC2) 貢獻(xiàn)率大的碳源為2種糖類碳源，分別是β-甲基-D-葡萄糖苷和α-D-乳糖，與PC2 正相關(guān)程度最高的碳源為β-甲基-D-葡萄糖苷(0.243)。利用PC1和PC2主成分將不同時(shí)期下土壤微生物群落劃分而起分異作用的主要碳源是糖類和胺類，這可能是植株、土壤養(yǎng)分與土壤特征微生物等相互作用的結(jié)果。

利用培養(yǎng)144 h的AWCD值，對(duì)3個(gè)處理和4個(gè)處理時(shí)期的土壤微生物碳源利用特性進(jìn)行主成分分析(圖4)，其中β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙?；?D-葡萄胺3種碳源主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為31.0%，其中4個(gè)時(shí)期的PC1方差貢獻(xiàn)率分別為72.95%，63.84%，66.00%，63.96%； PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為27.05%，36.12%,34.00%，36.04%。

由圖4和表3可知，30 d-PC1正軸方向分布的0.5倍增和1倍增大氣CO2濃度，碳源利用主要為氨基酸類、酯類和酸類，在30 d-PC2正軸方向分布的1倍增和自然環(huán)境大氣CO2濃度，6類碳源均有利用，其中酯類利用率最高。60 d-PC1正軸方向分布的自然環(huán)境和1倍增CO2濃度，利用的碳源主要為糖類、酯類和酸類，在60 d-PC2正軸方向分布的為1倍增CO2濃度，主要利用酯類和酸類。90 d-PC1正軸方向?yàn)?倍增CO2濃度，碳源均有利用，而90 d-PC2正軸方向則為0.5倍增和自然環(huán)境CO2濃度，前者主要利用酯類碳源，而后者則為氨基酸類碳源，其他碳源利用類似。處理120天同處理90天。

表3 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物PC1、PC2的碳源主成分載荷因子Tab.3 Carbon sources loading factors of PC1 and PC2 of PCA in the root zone of wolfberry under elevated CO2

圖4 CO2濃度升高處理下寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物碳源利用主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of carbon source utilization in the root zone of wolfberry under elevated CO2

3 討論

土壤微生物功能多樣性是指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過(guò)程，例如分解、營(yíng)養(yǎng)傳遞以及促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)的功能(賈夏等， 2013； 雷霆等， 2007)。本研究表明，大氣CO2濃度的增加對(duì)土壤微生物群落的活性產(chǎn)生顯著影響，這與徐國(guó)強(qiáng)等(2002)和Williams等(2000)的研究結(jié)果相似，但與Ronn等(2002)和Carrillo等(2018)認(rèn)為的CO2濃度升高對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響不顯著的結(jié)果不同。從理論上來(lái)說(shuō)，自然環(huán)境大氣CO2濃度分直接和間接來(lái)影響土壤微生物群落的活性和變化，直接影響主要為植株通過(guò)光合作用將CO2同化成有機(jī)物并將其運(yùn)輸至根系(王苑，2014)，根系通過(guò)分泌和死亡的方式將更多的營(yíng)養(yǎng)和能源供給微生物群落，從而引起土壤微生物分解速率和活性增強(qiáng)，生物量增加； 而土壤呼吸作用、土壤理化性質(zhì)、植物凋落物數(shù)量等都是影響微生物群落活性和變化的間接因素(Dijkstraetal.， 2011)。Williams等(2000)研究表明，自然環(huán)境大氣CO2濃度的增加會(huì)影響植物葉片某些化學(xué)成分的變化(非結(jié)構(gòu)C的增加)，從而導(dǎo)致葉片中其他物質(zhì)含量的變化，主要為N含量的減少和次生代謝物質(zhì)的增加，導(dǎo)致植物凋落物組成成分發(fā)生變化，碳氮比增加，土壤微生物分解活動(dòng)增大，導(dǎo)致土壤微生物活性的增大。

土壤中 CO2濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然環(huán)境大氣中的濃度，大氣 CO2濃度的升高會(huì)引起土壤中碳源供應(yīng)能力、水分和養(yǎng)分有效性發(fā)生變化,能顯著影響土壤微生物的群落和功能，土壤微生物群落的變化不僅與植物和土壤中的養(yǎng)分有關(guān)，而且與溫度、空氣、濕度及其他因素有著一定的聯(lián)系(Zaketal.， 2000)。Liu等(2017)研究指出，土壤中細(xì)菌的數(shù)量級(jí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌，在有機(jī)物轉(zhuǎn)化的過(guò)程中占有相當(dāng)大的比重，對(duì)于根周轉(zhuǎn)加速、根系分泌物的分解轉(zhuǎn)化等養(yǎng)分循環(huán)起著重要作用。物種多樣性指數(shù)是表征土壤中微生物群落的物種豐富度及其優(yōu)勢(shì)物種度和分布均勻程度的常用指數(shù)，其中最常見(jiàn)的3種指數(shù)為Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)，分別從不同角度反映土壤微生物群落的功能多樣性(鄧嬌嬌等， 2018)。從上述分析可以得出，大氣CO2濃度升高能使土壤微生物群落的物種豐富度、物種優(yōu)勢(shì)度及群落均勻度增加，但是隨著處理時(shí)間的增加，不同CO2濃度處理間土壤微生物的物種優(yōu)勢(shì)度逐漸減小，這可能是由于土壤微生物群落到處理后期對(duì)高濃度CO2具有了適應(yīng)能力。目前，國(guó)內(nèi)外利用BIO-ECO板來(lái)分析微生物群落的多樣性的同時(shí)，很少考慮培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間以及樣品處理等因素，其中，賈夏等(2013)、黨雯等(2015)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間和樣品預(yù)處理的不同在多樣性指數(shù)、碳源利用率均存在著差異。

在整個(gè)研究過(guò)程中，寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落所利用的碳源主要為氨基酸類、酯類和胺類，而對(duì)糖類和酸類利用率較低。氨基酸類為土壤有機(jī)氮的主要來(lái)源，植物無(wú)法直接利用含氮有機(jī)物中的氮素，必須先經(jīng)過(guò)微生物分解之后才能吸收;酯類和胺類則為土壤中最重要的有機(jī)成分(楊美玲等， 2018)。這一結(jié)果可能與寧夏枸杞根系分泌物具有一定的關(guān)系。根據(jù)Zak等(2010)關(guān)于CO2濃度升高對(duì)植物影響的47個(gè)研究進(jìn)行綜合分析顯示，CO2濃度升高會(huì)對(duì)植物生產(chǎn)力，植物根系有機(jī)酸、可溶性糖和有機(jī)酸等化合物的分泌有著巨大的改變，從而改變土壤微生物群落，使其提高土壤和微生物的呼吸速率。在31種碳源中，β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙?；?D-葡萄胺3種碳源是大氣CO2濃度升高后導(dǎo)致土壤微生物群落變化的敏感碳源。土壤微生物代謝功能類群有不同的碳源利用能力，植物的根系分泌物不同，所以導(dǎo)致其土壤微生物所利用的碳源也有所不同。

綜上所述，大氣CO2濃度升高可促進(jìn)寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物功能多樣性，可提高其碳源利用率，并改變部分碳源利用類型。本研究為寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物在氣候變化背景下的受大氣CO2濃度升高影響提供了一部分生理生化信息，為寧夏枸杞的培育和田間管理提供一定理論參考和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

通過(guò)大氣CO2濃度升高對(duì)寧夏枸杞1個(gè)生長(zhǎng)季土壤微生物群落功能多樣性的研究，可獲得以下結(jié)論： 1倍增大氣CO2濃度處理寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對(duì)31種碳源的平均利用率和4種多樣性指數(shù)均最高，自然環(huán)境大氣CO2濃度處理最低。寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落對(duì)氨基酸類、酯類和胺類碳源利用率較高，而糖類和酸類利用率較低，說(shuō)明氨基酸、酯類和胺類碳源是寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落利用并轉(zhuǎn)化的主要碳源。

大氣CO2濃度升高均能使微生物群落的活性及碳源利用率明顯增加，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物群落活性逐漸增強(qiáng)直至處理60天(7月份)后減弱，處理120天(9月份)時(shí)寧夏枸杞根區(qū)土壤微生物群落活性最弱。根據(jù)寧夏地區(qū)的氣候條件分析，這可能與微生物群落對(duì)于溫度較高、濕度較高的環(huán)境適應(yīng)力較高有關(guān)，尤其細(xì)菌。