李曉軍 安 軼 黃李超 曾 為 盧孟柱

(浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

楊樹(Populus)是主要造林樹種之一，是目前再生生物資源和森林碳匯的重要組分，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值。另外，楊樹生長快、適應性強、成材早、木材蓄積量大，且遺傳背景豐富、易于無性化擴繁和遺傳轉化，成為木本植物研究的模式物種(Janssonetal.， 2007； Polleetal.， 2013)。隨著毛果楊(Populustrichocarpa)、胡楊(P.euphratica)、新疆楊(P.bolleana)、銀腺楊84K(P.alba×P.glandulosa‘84K’)全基因組測序的完成(Tuskanetal., 2006; Maetal., 2013; 2019; Huangetal., 2020)，為楊樹這一木本模式植物功能基因組的研究提供了基礎。對木本植物來說，高大的樹體需要龐大的維管組織來支撐，同時運輸水分和營養(yǎng)物質。木材就是這些龐大的維管組織的產(chǎn)物，來源于維管形成層的活動。所以了解維管形成層活動的調控機制及木質部的分化是利用現(xiàn)代生物技術對木材材性進行遺傳改良的基礎。但獲得穩(wěn)定轉基因植株的效率低、周期長，這些限制阻礙了對木本植物木材相關基因功能的大規(guī)模高效率鑒定。因此，建立一種快速、便捷、高效的方法，用以揭示木材形成分子機制，變得尤為重要。

瞬時轉化技術可以避開冗長的轉基因過程，只需將目的基因導入組織或個體，不涉及再生過程，轉化之后直接進行基因表達分析或表型鑒定，具有操作簡單、周期短、通量高的優(yōu)點，可作為穩(wěn)定轉化的補充，特別適合應用于植物自身或異源基因功能及代謝途徑的大規(guī)模遺傳研究，并且可對無性繁殖困難的木本植株及同源植物系統(tǒng)(Korolevaetal., 2005; Yooetal., 2007)進行基因功能分析。近年來已有木本植物建立了瞬時轉化體系，用于品種的選育與開發(fā)，基因槍轉化(Nowaketal., 2004; Fizreeetal., 2019)、PEG介導原生質體轉化(Yooetal., 2007)、植物病毒載體介導轉化(Kumagaietal., 1995)和基于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(Yangetal., 2000; Simmonsetal., 2009)的轉化方法已成功應用于梨(Pyruscommunis)(Spolaoreetal., 2001)、甜橙(Citrussinensis)(de Oliveiraetal., 2009)、白樺(Betulaplatyphylla)、剛毛檉柳(Tamarixhispida)、黃檗(Phellodendronamurense)(Zhengetal., 2012)、桑(Morusalba)(Wuetal., 2015)、桂花(Osmanthusfragrans)(Hanetal., 2016)、柿(Diospyroskaki)(Moetal., 2019)、蘋果(Malusdomestica)(Lvetal., 2019)等。在楊樹中，通過PEG介導法成功獲得了瞬時轉化的葉片原生質體(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)； 通過基因槍轉化法成功獲得了瞬時轉化的葉片表皮細胞和保衛(wèi)細胞(Nowaketal., 2004)； 通過農(nóng)桿菌侵染技術獲得了瞬時轉化的葉片(Takataetal., 2012)和芽(Yangetal., 2009)，這都為木本植物的基因調控研究提供了快速可靠的技術支持。

然而，上述瞬時轉化技術只局限于原生質體、離體的葉片或芽，不利于研究木本植物形成層活動和木質部分化相關基因的功能。因此，本研究以銀腺楊84K 1年生休眠莖段為材料，通過水培觀察，表明其具有典型的形成層活動和木質部分化。以人工增強型綠色熒光蛋白(eYGFP)基因作為報告基因，建立農(nóng)桿菌介導的真空滲透侵染莖段的轉化體系，實現(xiàn)在形成層區(qū)域的外源基因表達，為木材形成和生長發(fā)育相關基因的研究提供了一種快速、高效的轉化方法，以促進木本植物木材形成機制的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年11月，在河北任丘中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所試驗基地，采集1年生銀腺楊無性系84K休眠期枝條。截取直徑約1 cm、長度約10 cm的莖段，封口膜包裹莖段兩端以防止失水，并低溫(4 ℃)保存。

1.2 載體構建和根癌農(nóng)桿菌轉化及鑒定

構建表達載體pK2GW7-eYGFP。首先根據(jù)Chin等(2018)所用載體克隆eYGFP表達序列35S-COR47-5′-UTR-eYGFP-HSP-T878(1 991 bp)，并通過酶切位點StuⅠ，使用同源重組方法將此序列構建到pK2GW7載體中(pK2GW7載體由浙江農(nóng)林大學韓瀟博士惠贈)。引物為F1(5′-CTGACCCACAGA TGGTTAGAGAGGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAAT TT-3′)和R1(5′-GATGAGACCTGCCGCGTAGGTG TGTACAGATATATGTTGAATTATTGA-3′)。轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)后，在含壯觀霉素(50 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，挑選陽性單克隆進行PCR鑒定。鑒定引物為F2(5′-CAGATGGTTAGAGAGGTGAGACTTTT-3′)和R2(5′-GACCTGCCGCGTAGGTGTGTACAGATAT-3′)。鑒定成功后提取質粒并利用凍融法將表達載體轉化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細胞中，并PCR鑒定。表達載體pK2GW7轉化至根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞用于試驗對照。

1.3 形成層活動的觀察

將休眠莖段從低溫環(huán)境取出，將其垂直培養(yǎng)在水中。對水培0、5、10、15、20、25、30天的莖段1/2處進行切片(40 μm，LEICA VT1200S)、20倍數(shù)顯微鏡下觀察形成層活動(LEICA DM6)。培養(yǎng)條件為： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強度50 μmol·m-2s-1。

1.4 遺傳轉化操作

采用凍融轉化法，將pK2GW7質粒和含eYGFP基因的雙元載體pK2GW7的質粒轉入農(nóng)桿菌GV3101，然后將農(nóng)桿菌于固體LB培養(yǎng)基(50 mg·L-1壯觀霉素)上培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度為28 ℃。挑取單克隆進行PCR檢測。檢測正確后按1∶100(V/V)的比例取活化菌液接種于200 mL YEB液體培養(yǎng)基(50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1壯觀霉素)中，并置于28 ℃、200 r·min-1搖床內過夜，搖菌至OD600= 0.8。分別對不帶載體、帶有pK2GW7、帶有pK2GW7-eYGFP的3種GV3101農(nóng)桿菌菌液，在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 880)下觀察，均未發(fā)現(xiàn)任何信號，故排除農(nóng)桿菌本底表達的影響。收集pK2GW7、pK2GW7-eYGFP菌體，菌體用重懸液(1/2MS，25 g·L-1蔗糖，10 mmol·L-1MES， 200 μmol·L-1AS，pH5.6)重懸。轉化前將低溫保存的84K楊莖段在含25%蔗糖的1/2 MS溶液中浸泡3 h，可促進轉化(Zhengetal., 2012)。將浸泡過的莖段豎直放入裝有重懸液的三角瓶中，莖段形態(tài)學下端浸入重懸液中，形態(tài)學上端與真空儀器通過橡膠管連接，在0.08 MPa壓強下，懸浮液從莖段形態(tài)學下端抽濾至形態(tài)學上端，轉化完畢的莖段進行水培，培養(yǎng)條件為： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強度50 μmol·m-2s-1。

1.5 農(nóng)桿菌介導的銀腺楊84K莖段瞬時轉化單因素試驗

根據(jù)楊樹遺傳轉化體系(Hanetal., 2000； Anetal., 2020)和桂花、朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)、蘋果、剛毛檉柳等其他木本植物遺傳轉化體系(Zhengetal., 2012； Trivellinietal., 2015； Hanetal., 2016； Lvetal., 2019)，本試驗選擇了影響農(nóng)桿菌介導的84K楊莖段瞬時轉化效率的轉化因子進行研究： 乙酰丁香酮(AS)濃度、農(nóng)桿菌濃度、真空滲透侵染時間、真空滲透侵染次數(shù)、侵染后培養(yǎng)時間。所有因子均設某單一因素為變量進行篩選，以報告基因eYGFP瞬時表達反映各因素對瞬時轉化率的影響(瞬時轉化率 = 觀察到eYGFP綠色熒光信號的莖段數(shù)目/總轉化莖段數(shù)目)，每個處理3次重復，每個重復至少6個莖段(P< 0.05； ANOVA)。

1.6 農(nóng)桿菌介導的銀腺楊84K莖段瞬時轉化因子正交試驗設計

為探究不同因素對84K楊莖段瞬時轉化的相互影響作用，本試驗進行了不同因素正交試驗以選擇最優(yōu)的因子組合。以eYGFP瞬時轉化率為考察指標，采用L9(34)正交試驗進行試驗設計(表1)。正交試驗每個處理3次重復，每個重復至少6個莖段。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.7 銀腺楊84K莖段瞬時轉化效率分析

轉化后的84K楊莖段可用LUYOR-3415RC手持熒光燈進行eYGFP初步觀察分析。在莖段1/2處進行切片，切片厚度為40 μm，并使用共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM 880)在493～558 nm的藍色激發(fā)光下觀察熒光信號。統(tǒng)計觀察到的eYGFP熒光信號，計算瞬時轉化率。

2 結果與分析

2.1 解除休眠后莖段形成層的活動及木質部分化

對休眠的莖段進行水培。如圖1A所示，培養(yǎng)0天時，形成層排列緊密，呈皺縮狀； 隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，第5天時的形成層細胞吸水逐漸恢復扁平狀態(tài)，形成層寬度和層數(shù)較0天時變化不顯著(圖1B、C)； 培養(yǎng)10天時，形成層層數(shù)顯著增加，寬度增加不顯著； 培養(yǎng)15天時，可觀察到新形成的次生木質部，相較之前形成的木質部細胞，其細胞壁較薄。其中可見體積膨大的細胞，為新形成的導管。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，新形成的次生木質部區(qū)域逐漸增加，并伴隨著大量新導管產(chǎn)生。培養(yǎng)20～30天期間，形成層寬度增加顯著，層數(shù)為5或6層。這表明1個月內水培休眠枝條可以模擬正常木材形成過程，新生的木質部細胞與前期形成的木質部沒有顯著差異。

2.2 載體構建及農(nóng)桿菌轉化鑒定

為建立銀腺楊84K莖段瞬時轉化系統(tǒng)，根據(jù)Chin 等(2018)所用載體克隆增強型eYGFP表達序列。將擴增產(chǎn)物通過同源重組方法連接到pK2GW7載體中，質粒轉入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中待用。pK2GW7-eYGFP載體如圖2所示。

圖1 室溫水培解除休眠后莖段形成層的活動和木質部分化Fig. 1 Cambium activity and xylem differentiation of dormancy-released stem segments cultured in water at room temperature A： 不同培養(yǎng)天數(shù)形成層變化。CZ： 形成層； P： 韌皮部； Pf： 韌皮纖維； r： 射線； V： 導管； X： 木質部。紅框代表新形成的次生木質部； 箭頭代表新形成的導管。標尺為100 μm。A: Changes of cambium zone following cultured days. CZ: Cambium zone; P: Phloem; Pf: Phloem fibre; r: Ray; V: Vessel; X: Xylem. Red rectangles indicate the newly secondary xylem; Arrowheads point to new vessels. Scale bars: 100 μm. B, C: P < 0.05; one-way ANOVA.下同。The same below.

圖2 pK2GW7-eYGFP表達載體示意Fig. 2 Schematic diagram of the pK2GW7-eYGFP vector

2.3 不同因素對84K楊莖段轉化的影響

2.3.1 乙酰丁香酮(AS)對eYGFP基因瞬時轉化率的影響 添加AS與不添加AS相比，eYGFP基因瞬時轉化效率明顯增加。當AS濃度為100、200、300 μmol·L-1時，轉化效率無顯著變化(圖3A)。故添加AS進行后續(xù)試驗，選擇AS濃度為200 μmol·L-1。

2.3.2 菌液濃度對eYGFP基因瞬時轉化率的影響 農(nóng)桿菌濃度OD600為0.3時瞬時轉化eYGFP基因成功率最低，隨著農(nóng)桿菌濃度增加，轉化率增加； 當農(nóng)桿菌濃度OD600增加到0.9時，瞬時轉化效率達到最高。隨著農(nóng)桿菌濃度提高到1.2或1.5時，轉化效率降低(圖3B)。說明菌液濃度過高或過低均會影響轉化效率。農(nóng)桿菌濃度過高，加快了莖段的腐爛速度，導致莖段生理狀態(tài)較差從而影響轉化率。

2.3.3 真空滲透侵染時間對eYGFP基因瞬時轉化率的影響 如圖3C所示，瞬時轉化率在真空滲透侵染時間5～15 min時較低，在達到20 min時顯著增加，在延長到30 min時反而下降。表明，真空滲透侵染達到一定時間后處于侵染飽和狀態(tài)，抽吸時間過長反而引起莖段結構損傷，影響轉化率。

2.3.4 真空滲透侵染次數(shù)對eYGFP基因瞬時轉化率的影響 隨著真空滲透侵染次數(shù)增加(每2次真空滲透侵染間隔72 h)，轉化率呈現(xiàn)出先增后降的趨勢。當用農(nóng)桿菌重懸液真空滲透侵染2次時，瞬時轉化率最高； 減少或增加真空滲透侵染次數(shù)，轉化率未顯著增加； 且當真空滲透侵染5次時瞬時轉化率最低(圖3D)。表明真空滲透侵染會不同程度地損傷莖段，抽吸次數(shù)越多損傷越大，導致轉化率越低。

2.3.5 培養(yǎng)天數(shù)對eYGFP基因瞬時表達的影響 真空滲透侵染后，將莖段進行水培。水培天數(shù)對瞬時轉化率也有較大影響(圖3E)。當水培天數(shù)較短時，如3天和6天，均觀察不到綠色熒光信號； 當培養(yǎng)到第9天時，可觀察到綠色熒光； 水培至12天時瞬時轉化率最高。隨后，隨培養(yǎng)時間增加，轉化率降低。

圖3 不同因素對84K楊莖段真空滲透轉化的影響Fig. 3 Effects of key factors on transient transformation of poplar 84K stem segments via vacuum infiltration

2.4 農(nóng)桿菌介導的84K楊莖段瞬時轉化體系的優(yōu)化

為優(yōu)化農(nóng)桿菌介導的84K楊莖段瞬時轉化效率，根據(jù)上述單因素試驗結果，通過L9(34)的正交試驗設計(表1)，共進行了9組不同水平處理的轉化因子組合試驗。表明水培天數(shù)、真空滲透侵染時間均對eYGFP瞬時轉化率有顯著影響(P< 0.05)，即水培天數(shù)和真空滲透侵染時間顯著影響農(nóng)桿菌介導銀腺楊84K莖段瞬時轉化率，而菌液濃度和真空滲透侵染次數(shù)的影響不顯著(表2)。4個因素對轉化率的影響為： 侵染后水培天數(shù)>真空滲透侵染時間>菌液濃度>真空滲透侵染次數(shù)。

通過表1顯示，農(nóng)桿菌介導的真空滲透瞬時轉化銀腺楊84K莖段的最優(yōu)組合是農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD600= 0.9、真空滲透侵染20 min、真空滲透侵染2次、侵染后水培15天。

2.5 瞬時轉化后eYGFP的表達觀察

瞬時轉化后進行水培，經(jīng)切片顯微觀察，維管組織發(fā)育情況與休眠莖段水培的維管組織發(fā)育情況類似。形成層細胞從最初的皺縮狀恢復到扁平狀，形成層層數(shù)也隨之增加，培養(yǎng)15天可觀察到新形成的次生木質部細胞。瞬時轉化后的莖段維管發(fā)育也可追蹤從形成層活動到木質部形成的全過程。84K楊莖段瞬時轉化后水培15天時的eYGFP表達情況初步觀察如圖4所示。圖4A為正常光下莖段整體情況，莖段下部剝掉部分樹皮，露出形成層區(qū)域。經(jīng)激發(fā)光照射在已轉化的莖段形成層區(qū)域可觀察到eYGFP綠色熒光信號(圖4B中紅箭頭所示)，紅色為自發(fā)熒光。正常光下莖段橫截面如圖4C所示，照射激發(fā)光后在莖段橫截面上也可觀察到明顯的eYGFP綠色熒光信號(圖4D)。

表1 84K楊莖段瞬時轉化因子L9 (34)正交試驗設計(均值±標準誤)Tab.1 Factors and levels of L9 (34) orthogonal experiments(Mean ± SE)

圖5 瞬時轉化后eYGFP在不同部位的表達情況Fig. 5 eYGFP expression in different regions A： 周皮(Pd)、皮層(Co)、韌皮部(Ph)； B： 形成層區(qū)域(CZ)； C： 木質部(Xy)； D： 髓(Pi)； E： 髓射線(PiR)。標尺= 50 μm。A: Periderm(Pd), Cortex(Co), and Phloem(Ph); B: Cambium zone(CZ); C: Xylem(Xy); D: Pith(Pi); E: Pith rays(PiR). Scale bars = 50 μm.

為進一步探究84K楊莖段轉化后eYGFP綠色熒光信號具體部位，對莖段1/2處進行切片觀察。通過共聚焦顯微鏡觀察不同部位eYGFP的表達情況，在周皮、皮層、韌皮部、木質部、髓中未觀察到綠色熒光信號(圖5A、C、D)。而在形成層區(qū)域細胞中可觀察到較多的綠色熒光信號(圖5B)，同時在髓射線中也可觀察到較少的微弱熒光信號(圖5E)。結果顯示瞬時轉化后eYGFP的表達主要集中在形成層區(qū)域。說明外源基因可以在形成層細胞中表達，有利于鑒定它們在形成層活動及分化為木質部中的作用。

3 討論

現(xiàn)代生物技術的迅猛發(fā)展已推動林木研究從傳統(tǒng)育種轉向分子育種，而利用現(xiàn)代生物技術對木材進行遺傳改良，首先必須了解木材形成的復雜過程。目前，研究木本植物的木材相關基因大多以穩(wěn)定的遺傳轉化植株為材料。穩(wěn)定遺傳轉化技術需要把目的基因整合到宿主基因組中，使宿主具有目的基因所表現(xiàn)的性狀、功能和表型。多數(shù)穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導轉化需要再生體系，這是一個繁瑣且漫長的過程。由于木本植物具有雜合性高、繁殖時間長、轉化效率低等特點，不能快速獲得大量轉基因植株，且仍有相當一大部分木本植物再生體系沒有建立，遺傳改良受到限制(Gambinoetal., 2012； van Nockeretal., 2014)。與穩(wěn)定遺傳轉化體系相比，瞬時轉化技術不涉及再生過程，可在轉化之后直接進行表型鑒定，周期短且轉化效率高(Uenoetal., 1996)。然而，瞬時轉化大多以葉片(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)為轉化材料，雖轉化體系較為成熟，但轉化過程損壞了轉化材料使其無法繼續(xù)正常生長。而且由于轉化材料組織的限制，更不利于木本植物木材發(fā)育相關基因的研究。

本試驗在不破壞植物材料的前提下，通過真空滲透侵染的方法建立了農(nóng)桿菌介導的銀腺楊84K莖段瞬時轉化體系。試驗通過研究菌液濃度、真空滲透侵染時間、真空滲透侵染次數(shù)、侵染后水培天數(shù)等轉化因子，采用正交設計優(yōu)化試驗，結果表明真空滲透侵染時間和水培天數(shù)對eYGFP瞬時轉化率有顯著影響。真空滲透侵染方法通過真空壓力將農(nóng)桿菌菌液從莖段下端抽至莖段上端，此操作方便快捷且可批量轉化。此方法增加了84K楊莖段導管的運輸能力和細胞的滲透性，使載體更容易進入植物細胞。切片觀察結果表明eYGFP報告基因主要在恢復活力的形成層區(qū)域中表達(圖5)。說明相較于其他的葉或芽等材料的瞬時轉化體系，本體系能提供形成層細胞相關基因的原位表達，這都有利于鑒定它們在形成層活動方面的作用。試驗結果表明，侵染后水培9～20天后目標基因的表達水平都較高(圖3E)，農(nóng)桿菌轉化后直接進行水培，15天之前休眠莖段的主要活動是形成層恢復活力，形成層層數(shù)和寬度都有所增加。如果研究的目標基因參與形成層細胞活動，則可在15天之前進行形成層細胞的早期表型變化觀察。而15天左右可觀察到新形成的次生木質部。因此研究木質部發(fā)育相關基因的功能，可在15天后再進行維管組織發(fā)育的表型變化觀察。本體系的建立可以追蹤木質部形成的全過程，所以可利用它研究形成層及木質部發(fā)育的相關基因功能，但需要注意觀察分析時間。

建立高效的瞬時表達系統(tǒng)，有助于植物基因功能的研究。本體系在不破壞植物材料的基礎上，可快速、便捷、高效地獲得瞬時轉化材料，特別有助于研究維管組織發(fā)育相關基因。此方法建立對揭示木材形成的分子機制有重要意義，同時也可為研究其他木本植物木材形成相關基因提供借鑒。

4 結論

本研究建立了銀腺楊84K莖段真空滲透瞬時轉化體系： 農(nóng)桿菌重懸液OD600為0.9，抽真空20 min，根癌農(nóng)桿菌真空滲透侵染2次，水培15天。外源基因主要在銀腺楊84K莖段形成層細胞中表達，可以快速鑒定其在維管組織分化中的功能，有助于研究木質部發(fā)育的調控機制，也可為其他木本植物的木材品質研究提供新思路。