程 俠，吳毅彥，郝桂明，王 衛(wèi)

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

氨酚咖匹林片的主要成分為對乙酰氨基酚、咖啡因和阿司匹林，是一種解熱鎮(zhèn)痛藥的非處方藥，對氯苯乙酰胺和對氨基酚是對乙酰氨基酚原料藥含有的兩個主要雜質(zhì)，均是對乙酰氨基酚合成過程中引入的雜質(zhì)［1］，毒性較大［2-3］。為了保證藥品的安全，有必要控制對氯苯乙酰胺和對氨基酚的含量，而氨酚咖匹林片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-10001（HD-1126）-2002-2009］和相關(guān)文獻中均沒有檢測這兩個雜質(zhì)含量的方法。本試驗建立了一個HPLC 方法同時測定對氯苯乙酰胺和對氨基酚的含量，旨在提高氨酚咖匹林片的質(zhì)量控制技術(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695 高效液相色譜儀，配有自動進樣器、2998PDA 檢測器、Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；Mettler XPE105 電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥 對氯苯乙酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 100850-201803，含量：100%），對氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100802-201203，含量：100%）；7 批氨酚咖匹林片樣品為抽驗樣品，規(guī)格：阿司匹林0.226 8 g，咖啡因33.4 mg，對乙酰氨基酚 0.136 g（廠家 A，批號 2010080、2010082、2011086、2010081、2007077、2006069、2001009）；甲 醇（色譜純，默克公司）；水為超純水；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、25%四丁基氫氧化銨溶液均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACCHROM XUnion C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 A 為磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉8.95 g，磷酸二氫鈉3.9 g，加水溶解至1 000 ml，加25%四丁基氫氧化銨溶液4.8 ml），流動相B 為甲醇，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；檢測波長：245 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品貯備液 精密稱取對氯苯乙酰胺對照品10.06 mg 和對氨基酚對照品20.19 mg 分別置20 0 ml 和 20 ml 量瓶中，分別加溶劑［水-甲醇（60∶40）］適量，振搖10 min，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對氯苯乙酰胺和對氨基酚對照品貯備液；精密量取上述2 種對照品貯備液各10 ml 置同一100 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 精密量取混合對照品貯備液10 ml 置100 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液（約含對氯苯乙酰胺0.5 μg/ml，對氨基酚 10 μg/ml）。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取本品細粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.2 g），置20 ml 量瓶中，加溶劑10 ml，振搖10 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 供試品加標(biāo)溶液 精密稱取本品細粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.2 g），置20 ml 量瓶中，精密加入混合對照品貯備液2.0 ml，加溶劑10 ml，振搖10 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品加標(biāo)溶液。

2.2.5 空白溶液 水-甲醇（60∶40）溶液。

2.3 專屬性試驗 取空白溶液、混合對照品溶液、供試品加標(biāo)溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。對照品色譜圖中對氨基酚峰和對氯苯乙酰胺峰的理論板數(shù)分別為10 287 和118 364；供試品加標(biāo)溶液色譜圖中對氨基酚峰和對氯苯乙酰胺峰與各自相鄰峰均能分離良好，其中對氨基酚峰與其相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度為2.2，對氯苯乙酰胺峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度為3.3；空白無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 空白對照（A）混合對照品（B）供試品加標(biāo)（C）供試品（D）HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系與范圍 分別精密量取混合對照品貯備液 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 和 12.5 分別置 50 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品系列溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以濃度C 為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)如下：對氯苯乙酰胺A=110 396 C-1 568.1（r=0.999 9）；對氨基酚 A=35 763 C-3 040.5（r=0.999 9）。結(jié)果表明：對氯苯乙酰胺和對氨基酚分別在0.05~1.26 μg/ml 和 0.20~25.24 μg/ml 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢測限 取混合對照品貯備溶液，分別用溶劑逐級稀釋，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以信噪比S/N 值達到3 左右時計算檢測限，結(jié)果對氯苯乙酰胺為 0.025 μg/ml，對氨基酚為 0.01 μg/ml。

2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液連續(xù)進樣6 次，計算對氯苯乙酰胺和對氨基酚峰面積的RSD 分別為0.2%和0.4%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取氨酚咖匹林片樣品（批號2007077）細粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.2 g）6 份，置20 ml量瓶中，按“2.2.3”項下方法配制供試品溶液，分別進樣，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，結(jié)果對氨基酚的含量為0.001 9%，RSD 為0.84%，對氯苯乙酰胺未檢出，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取混合對照品溶液，放置0、1、2、4、6、8、10 和 12 h 后，按上述色譜條件測定，對氯苯乙酰胺和對氨基酚峰面積的RSD 分別為0.46%和1.78%（n=6），對氯苯乙酰胺在12 h 內(nèi)比較穩(wěn)定，但對氨基酚在4 h 后開始出現(xiàn)降解現(xiàn)象。因此，溶液配制好后應(yīng)于低溫保存并盡快進樣分析［4-5］。

2.9 回收率試驗 精密稱取已知含量的氨酚咖匹林片樣品（批號2010080）細粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.2 g）9 份，置20 ml 量瓶中，分別加入混合對照品貯備液 1.6、2.0 和 2.4 ml，每個濃度各 3 份，按“2.2.3”項下方法分別配制溶液，分別進樣，結(jié)果對氨基酚平均回收率為100.34%，RSD 為0.63%；對氯苯乙酰胺平均回收率為100.72%，RSD 為1.35%。見表2 和表3。

表2 對氨基酚回收率試驗結(jié)果（n=9）

表3 對氯苯乙酰胺回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.10 樣品測定 對7 批樣品，按“2.2.3”項下方法分別配制供試品溶液，另取混合對照品溶液，分別進樣測定，并按外標(biāo)法以峰面積分別計算兩個雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表4。對氨基酚的含量測定結(jié)果均在其濃度線性范圍內(nèi)。

表4 樣品測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 《中國藥典》2015 年版二部中收載的對乙酰氨基酚原料藥［6］中“對氯苯乙酰胺”和“對氨基酚及有關(guān)物質(zhì)”的測定方法采用了兩個色譜系統(tǒng)來測定這兩個雜質(zhì)的含量，工作效率低且成本高。本方法在《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化了色譜條件，采用梯度洗脫的方法，在較短時間內(nèi)同時測定對氯苯乙酰胺和對氨基酚的含量，且在測定的7 批樣品色譜圖中對氯苯乙酰胺和對氨基酚均能與相鄰的雜質(zhì)峰得到很好的分離。此方法專屬性好，線性、精密度和回收率良好，可快速測定氨酚咖匹林片中的對氯苯乙酰胺和對氨基酚的含量。

3.2 溶液穩(wěn)定性 此次考查結(jié)果表明，常溫下對照品溶液中對氨基酚峰在4 h 后開始出現(xiàn)降解趨勢，雖然對氨基酚峰的峰面積在12 h 內(nèi)的RSD＜2.0%，仍建議溶液配制好后于低溫保存并盡快進樣分析。

3.3 樣品的測定 《中國藥典》2015 年版二部中收載的對乙酰氨基酚原料藥［6］中對氯苯乙酰胺和對氨基酚的限度均為0.005%，收載的對乙酰氨基酚片［6］中對氯苯乙酰胺的限度為0.005%，對氨基酚的限度為0.1%。此次考查的7 批樣品中，對氯苯乙酰胺均未檢出，其中有3 批檢出對氨基酚，但含量均小于0.05%，說明這7批樣品對這兩個雜質(zhì)的質(zhì)量控制得較好。