岳穎蓉，方芳，徐潤澤，操家順

(1.河海大學(xué) 淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇，南京 210098)

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是由微生物合成的一種胞內(nèi)聚酯，其具有與傳統(tǒng)石油化工類塑料相似的性質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、建筑、制藥及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1]。雖然人們廣泛關(guān)注PHA的生產(chǎn)，但是高成本的碳源限制了PHA市場的進(jìn)一步發(fā)展[2]。甲烷是自然界中一種重要的溫室氣體，具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和很強(qiáng)的溫室效應(yīng)。大部分的甲烷排放源于人工，主要有化石燃料、畜牧業(yè)、厭氧廢物處理、煤炭開采和廢水處理等[3]。目前研究表明甲烷氧化菌可以以甲烷為唯一碳源和能源，在營養(yǎng)限制條件下合成生物聚合物PHA[4]。因而將甲烷作為低成本的原料生物轉(zhuǎn)化為高附加值的PHA，既可以增加污水中資源的回收，又有助于緩解氣候變化問題。

近年來，研究者們已經(jīng)就甲烷氧化菌利用甲烷作為電子供體合成PHA進(jìn)行了大量的研究，并取得了一定的進(jìn)展。但是，大多數(shù)研究仍局限于小試實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用，且合成的PHA種類較為單一。因此，本文首先就PHA的性質(zhì)及應(yīng)用展開闡述；然后綜述了關(guān)于甲烷氧化菌合成PHA的能力與生物代謝途徑的研究，并強(qiáng)調(diào)了不同環(huán)境因素對甲烷氧化菌利用甲烷合成PHA的影響；最后針對目前研究存在的問題提出了相應(yīng)的策略，為未來研究利用甲烷高效合成PHA提供解決思路。

1 聚羥基脂肪酸酯(PHA)

1.1 PHA 的結(jié)構(gòu)及分類

聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種由微生物在碳源充足而N、P、微量元素等營養(yǎng)限制的條件下合成的細(xì)胞內(nèi)聚酯[5]。其顆粒大小為0.2～0.5 μm，可作為碳源和能源貯存物，在碳源不足的情況下進(jìn)行利用。PHA主要由羥基脂肪酸(HA)聚合而成，大多數(shù)單體的鏈長為3～14個(gè)碳原子，側(cè)鏈為高度可變的芳香族或脂肪族基團(tuán)[6]。根據(jù)單體碳鏈長度的不同，可將PHA分為短鏈、中鏈和長鏈三類。短鏈PHA的碳原子數(shù)為3～5個(gè)，在古細(xì)菌、革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中廣泛分布，可形成常見的聚合物，如聚羥基丁酸酯(PHB)、聚羥基戊酸酯(PHV)等；中長鏈PHA的碳原子數(shù)為6～14個(gè)，大多存在于假單胞Pseudomonas中；長鏈PHA的碳原子數(shù)超過14，但并不常見且研究較少。此外，根據(jù)單體連接樣式不同，可將PHA分為均聚、無規(guī)共聚、嵌段共聚三類。均聚PHA中只含有一種單體，無規(guī)共聚PHA由多種單體隨機(jī)聚合而成，嵌段共聚PHA由多個(gè)鏈段構(gòu)成，且每個(gè)鏈段只含有一種單體[7]。

1.2 PHA的性質(zhì)及應(yīng)用

由于PHA的單體結(jié)構(gòu)具有可變性，使得其物理化學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性能，如韌度、脆性、熔點(diǎn)、玻璃態(tài)溫度和抗溶劑性等，都會隨著單體數(shù)量和組成的變化而發(fā)生改變[8]，可根據(jù)不同的需求針對性地選擇不同的PHA。短鏈PHA結(jié)晶度較高，可制得性質(zhì)堅(jiān)硬而脆的硬塑料；而中長鏈PHA結(jié)晶度較低，可制得性質(zhì)韌而軟的彈性體塑料。通過物理和化學(xué)等方法還可改變PHA結(jié)晶性能，提高其機(jī)械性能，從而拓寬PHA的應(yīng)用范圍。PHA還具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性。PHA良好的生物相容性表現(xiàn)在它能夠?yàn)槎喾N組織器官細(xì)胞提供生長環(huán)境，不會導(dǎo)致癌癥且大多可轉(zhuǎn)化為動物體內(nèi)本身存在的物質(zhì)。因此，將PHA材料用作醫(yī)療植入性材料和用于藥物的可降解載體具有極大的潛力[9]。PHA的生物降解性表現(xiàn)為不同的微生物會產(chǎn)生不同的PHA解聚酶來降解PHA[10]，在自然條件下可被微生物完全降解。

2 甲烷作為電子供體用于PHA合成

2.1 甲烷氧化菌

甲烷氧化菌是一類利用甲烷作為碳源和能源的革蘭氏陰性菌，在好氧條件下可將甲烷轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)、二氧化碳和生物聚合物[11]。甲烷氧化菌廣泛分布在濕地、森林、海洋、湖泊、稻田、煤礦、地下水、垃圾填埋場、污水污泥等各種環(huán)境中。甲烷氧化菌根據(jù)其生理和形態(tài)特征分為三類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型甲烷氧化菌[11-12]。Ⅰ型甲烷氧化菌通過核糖磷酸(RuMP)途徑進(jìn)行碳同化；Ⅱ型甲烷氧化菌利用絲氨酸途徑進(jìn)行碳同化；而Ⅹ型甲烷氧化菌具有Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌的特征，通過RuMP途徑吸收甲醛，并利用絲氨酸途徑固定CO2[13]。

當(dāng)前已知的甲烷氧化菌可基于16 S rRNA分為兩個(gè)不同的門，即變形菌門(細(xì)分為α-和γ-Proteobacteria)和疣微菌門[14]。α-Proteobacteria門中最有代表性的屬是Methylocystis、Methylosinus、Methylocella和Methylocapsa，它們屬于Methylocystaceae和Beijerinckiaceae科，為Ⅱ型甲烷氧化菌；而γ-Proteobacteria門中的甲烷氧化菌有Methylomonas、Methylobacter、Methylosarcina和Methylococcus等屬，它們屬于Methylococcaceae科，為Ⅰ型甲烷氧化菌。

2.2 純種或混合甲烷氧化菌合成PHA的能力

早在1970年，Whittenburry等研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型甲烷氧化菌具有將甲烷轉(zhuǎn)化為PHB的能力[12]。此后，眾多研究者對利用甲烷氧化菌將甲烷轉(zhuǎn)化為PHB展開了大量的研究。不同實(shí)驗(yàn)條件下Ⅱ型甲烷氧化菌積累PHB的能力見表1。

Methylocystis、Methylosinus和Methylobacterium是目前研究較多的3個(gè)屬。 其中，Methylocystis屬在不同環(huán)境下的混合菌群中均占主導(dǎo)地位，對其的研究最為廣泛[15-17]。MethylocystisparvusOBBP的最大PHB積累量可達(dá)到36%～70%，而Methylocystishirsuta的PHB積累量變化范圍較大，為7%～85%[4,15,18-19]。Methylosinus和Methylobacterium是另外兩個(gè)PHB積累量較高的屬[18,20-21]。從不同環(huán)境樣品分離到的Methylosinustrichosporium可獲得25%～51%的PHB積累[21-22]，在MethylobacteriumorganophilumCZ 2中最多可獲得57%的PHB積累[21]。

表1 甲烷氧化菌的PHB積累能力

除了對純甲烷氧化菌進(jìn)行培養(yǎng)，人們還可考慮利用混合甲烷氧化菌群合成PHA，從而降低純菌操作的成本，并可獲得相似的PHA積累。在營養(yǎng)限制的條件下，對Methylocystissp.GB25(占混合菌群的86%)進(jìn)行混合培養(yǎng)，PHB積累可在約24 h內(nèi)達(dá)到最大值(33.6%)[26]。在開放條件下以甲烷為底物培養(yǎng)甲烷氧化菌群，PHB積累量可達(dá)到35.5%，且開放培養(yǎng)過程中菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[27]。PHA的積累與甲烷氧化菌的接種種齡直接相關(guān)，通常在穩(wěn)定生長期PHA的積累量達(dá)到最高值[16]，純種和混合甲烷氧化菌獲得最大PHA積累的時(shí)間往往有所不同。研究發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)Methylocystisparvus可在170～180 h達(dá)到28%的PHB積累[4]，而混合菌群可在培養(yǎng)144 h內(nèi)達(dá)到類似的積累效果(27.5%)[28]。同樣，以MethylocystishirsutaCSC1為優(yōu)勢種的混合菌群中，PHB積累量在接種后80 h內(nèi)達(dá)到了42.5%[16]，而純培養(yǎng)MethylocystishirsutaCSC1僅積累了7%的PHB[18]。這表明，相較于純甲烷氧化菌培養(yǎng)，混合甲烷氧化菌群可以在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的PHB積累量。

2.3 甲烷氧化途徑和甲烷氧化菌中PHA的合成

甲烷氧化菌氧化甲烷與合成PHA的途徑見圖1(見后)。甲烷氧化菌通過逐步反應(yīng)將甲烷氧化為CO2，生成甲醇、甲醛、甲酸作為中間體[29]。甲烷單加氧酶(MMO)可以催化甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇，通常以細(xì)胞內(nèi)膜上的顆粒形式(pMMO)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性形式(sMMO)出現(xiàn)。sMMO一般由Ⅱ型甲烷氧化菌合成，很少有Ⅰ型甲烷氧化菌能夠合成sMMO[13]。首先MMO催化甲烷氧化為甲醇，接著由甲醇生成具有細(xì)胞毒性的甲醛。在此階段甲烷氧化菌需要高濃度的還原當(dāng)量，將甲醛轉(zhuǎn)化為甲酸并進(jìn)一步同化為細(xì)胞生物質(zhì)。在Ⅰ型甲烷氧化菌中，3-己糖磷酸合酶催化甲醛合成(D-阿拉伯糖)-3-己糖-6-磷酸，再轉(zhuǎn)化為不同的中間產(chǎn)物進(jìn)入RuMP途徑，通過不完全的TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為CO2。而在Ⅱ型甲烷氧化菌中，四氫葉酸催化甲醛氧化進(jìn)入絲氨酸途徑，隨后在營養(yǎng)充足的條件下進(jìn)行TCA循環(huán)產(chǎn)生CO2。一旦在培養(yǎng)液中出現(xiàn)了營養(yǎng)限制的情況，乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)受到限制，Ⅱ型甲烷氧化菌就會將過量的乙酰CoA轉(zhuǎn)移到PHA/PHB循環(huán)中，合成PHA/PHB。首先通過由PhaA基因編碼的3-酮硫解酶催化乙酰CoA轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰CoA。隨后，通過由PhaB基因編碼的乙酰乙酰CoA還原酶將其轉(zhuǎn)化為3HB-CoA。最后，通過由PhaC基因編碼的PHA合酶將3HB-CoA聚合成P(3HB)[30]。

甲烷的生物降解可通過RuMP途徑和絲氨酸途徑實(shí)現(xiàn)，兩個(gè)途徑的化學(xué)計(jì)量如公式(1)和(2)[29]：

RuMP途徑：

0.118(C4H3O2N)+0.529CO2+1.71H2O+0.118H+

(1)

絲氨酸途徑：

0.102(C4H3O2N)+0.593CO2+1.75H2O+0.102H+

(2)

Ⅰ型甲烷氧化菌的RuMP途徑能夠更高效地轉(zhuǎn)化甲烷，在甲烷氧化過程中形成3個(gè)甲醛分子僅需要1個(gè)ATP分子。雖然Ⅱ型甲烷氧化菌可以更好地將甲烷儲存為磷脂脂肪酸和生物聚合物(即PHA)[11,14]，但它們需要3個(gè)ATP和2個(gè)NADH分子才能通過絲氨酸途徑固定2個(gè)甲醛和1個(gè)CO2分子。這表明在混合培養(yǎng)條件下Ⅰ型甲烷氧化菌的生長比Ⅱ型甲烷氧化菌具有優(yōu)勢，因此在進(jìn)行PHA積累階段之前，需要選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件對混合菌群中的Ⅱ型甲烷氧化菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，以排除Ⅰ型甲烷氧化菌。

3 影響甲烷氧化菌利用甲烷合成PHA的因素

甲烷氧化菌中的PHA含量和性質(zhì)受到多個(gè)因素的影響，例如甲烷、O2、氮、磷、微量營養(yǎng)元素、pH、溫度等。為實(shí)現(xiàn)PHA的最大化積累，必須對這些相互聯(lián)系的影響因素進(jìn)行解析，使其保持在最佳范圍內(nèi)。

3.1 甲烷和O2的含量

甲烷氧化菌會受到甲烷濃度變化的影響。相比于Ⅰ型甲烷氧化菌，Ⅱ型甲烷氧化菌對甲烷含量變化的耐受性更高。低濃度的甲烷會使Ⅱ型甲烷氧化菌中的關(guān)鍵酶sMMO失活，因此需要其他能源來維持細(xì)胞活性并提供還原當(dāng)量[31]，而甲烷的濃度過高也會對PHA的合成產(chǎn)生抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)在20 g 和2 g CH4/m3下PHB的最大積累量分別達(dá)到1.0%和12.6%(w/w)[32]。因此，需要控制甲烷濃度在合適的范圍內(nèi)，既保證甲烷營養(yǎng)菌與其關(guān)鍵酶的活性，又要盡可能提高PHA的積累量。

3.2 營養(yǎng)物氮磷含量

同樣，磷源限制可以促進(jìn)PHA的積累。Methlocystissp.GB25 DSMZ 7674在磷源限制時(shí)，其PHA的最大積累量為0.55 g PHB/g CH4[23]。在磷源限制條件下，Methylocystis和Methylobacterium成為優(yōu)勢屬，且在25 ℃時(shí)PHB含量高達(dá)(13.6±5.6)%[34]。維持sMMO和甲醇脫氫酶活性所需的最佳P濃度范圍為2～25 mmol/L，而當(dāng)P濃度>40 mmol/L時(shí)會抑制Ⅱ型甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b的生長[35]。因此，在利用甲烷合成生物聚合物的過程中提供適量的P也至關(guān)重要。

3.3 微量營養(yǎng)元素

微量營養(yǎng)元素含量的變化也會對甲烷氧化菌的生長產(chǎn)生影響。研究表明K和Mg的濃度對Ⅱ型甲烷氧化菌積累PHA會產(chǎn)生影響，對K和Mg進(jìn)行限制可以促進(jìn)PHA的積累。當(dāng)培養(yǎng)液中的K濃度控制在17 mg/L時(shí)，以Methlocystissp.GB25為優(yōu)勢菌的混合菌群積累了33.6%的PHB，且在K限制的條件下生成了具有3.1 MDa的超高平均分子量的聚合物[26]。當(dāng)培養(yǎng)液中的K濃度降至25 mg/L以下時(shí)，Methylobacteriumorganophilum進(jìn)行PHB的積累，培養(yǎng)70 h后獲得的PHB積累量為52%～56%[25]。Mg的添加對sMMO活性、細(xì)胞生長和甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇的效率均有積極影響。而在Mg限制條件下，以Methlocystis sp.GB25為優(yōu)勢菌的混合菌群可以積累28.3%的PHB且生成的PHB分子量高達(dá)2.5 MDa[23]。 這表明K和Mg限制不僅有利于PHA的積累，還能產(chǎn)生高分子量的PHA。

Cu和Fe等金屬離子會通過對甲烷氧化菌MMO活性的調(diào)節(jié)影響其合成PHA。Cu可以控制編碼MMO的基因表達(dá)，并對pMMO和sMMO的活性有積極作用[14]。添加的Cu含量需要控制在一定的范圍內(nèi)。研究表明過高的Cu含量會抑制sMMO的活性和甲烷氧化菌的生長，而一定的初始Cu濃度有利于pMMO活性的表達(dá)，有助于細(xì)胞中PHB的合成[35]。研究發(fā)現(xiàn)加入了30 mol/L Cu后MethylosinustrichosporiumIMV 3011中的pMMO活性提高到未添加Cu的4倍，細(xì)胞密度為未添加Cu的2倍，PHB含量增加到8.3%[36]。而Fe含量也會對MMO的活性產(chǎn)生影響，維持sMMO活性的最佳Fe濃度范圍為40～80 μmol/L，然而超過最佳Fe濃度范圍并未觀察到會對MethylosinustrichosporiumOB3b的生長產(chǎn)生顯著影響[35]。較高的Fe濃度可以減輕銅胺絡(luò)合物的抑制作用，因此可就Cu和Fe對PHA積累的聯(lián)合影響進(jìn)行研究，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且高效的培養(yǎng)。

3.4 溫度和pH

利用純甲烷氧化菌或混合菌群進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，pH值會對PHA的積累產(chǎn)生影響。通常用于富集Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌的培養(yǎng)基pH值介于6.8～7.0。由于Ⅱ型甲烷氧化菌需要CO2作為絲氨酸循環(huán)的輸入，而較低的pH值有助于溶解CO2。因此，Ⅱ型甲烷氧化菌對低pH值的耐受性比Ⅰ型甲烷氧化菌更高[18]，略酸性的pH對于Ⅱ型甲烷氧化菌的生長和PHA積累量的增加更為有利。在pH值分別為3.6～4.5,5.0～6.0和6.0～6.2的情況下，Methylocella、Methylocapsa和Methylocystis屬的一些菌種的生長得到了促進(jìn)，這表明這些菌種最適于偏酸性的培養(yǎng)條件[18,31]。

溫度是影響甲烷氧化菌積累PHA的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。甲烷氧化菌通常在常溫條件下表現(xiàn)出較好的PHA積累能力。在較高溫度(30,37 ℃)時(shí)，PHA的積累量最多可增加30%，且Methylocystis始終為優(yōu)勢菌屬[37]。此外，在反應(yīng)器55 ℃和58 ℃培養(yǎng)嗜熱型甲烷氧化菌時(shí)發(fā)現(xiàn)將溫度提高到58 ℃時(shí)PHA積累率未受顯著影響。這表明甲烷氧化菌具有在高溫條件下利用甲烷生產(chǎn)PHA的潛力[38]。因此，可以考慮研究在較廣泛的溫度范圍下甲烷氧化菌大規(guī)模合成PHA的情況。

4 數(shù)學(xué)模型在甲烷氧化菌生物合成PHA方面的應(yīng)用

數(shù)學(xué)模型的建立可以評估甲烷氧化菌利用甲烷生產(chǎn)PHA的經(jīng)濟(jì)性。通過數(shù)學(xué)模型，我們可以獲得較高的比生長速率、較高的底物利用率和較高水平的PHB生產(chǎn)，從而獲取最大化收益。O2和氮源的變化會對MethylosinustrichosporiumOB3b和MethylocystisparvusOBBP的生長和PHB的積累產(chǎn)生影響，我們可以通過建立化學(xué)計(jì)量學(xué)和動力學(xué)模型對其進(jìn)行描述，從而為生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、大規(guī)模生產(chǎn)和生命周期評估(LCA)提供更有價(jià)值的信息[15]。通過批量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立Methylocystishirsuta的化學(xué)計(jì)量學(xué)和動力學(xué)的模型，所獲得的模型和參數(shù)不僅有利于生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作，而且還能夠從不同環(huán)境中篩選出Ⅱ型甲烷氧化菌進(jìn)行具體研究[39]。建立MethylocystisparvusOBBP的基因組規(guī)模代謝模型(GSMM)與PHB和甲烷共同消耗的模型，并將其與Methylocystishirsuta、Methylocystissp.SC2的模型進(jìn)行比較，可闡明了MMO的甲烷氧化機(jī)理，準(zhǔn)確預(yù)測生物量的產(chǎn)量和耗氧率，并揭示PHB降解的回補(bǔ)作用[40]。

5 利用甲烷氧化菌如何高效合成PHA

5.1 生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)

目前，進(jìn)行甲烷氧化菌生物合成PHA的研究大部分是小試實(shí)驗(yàn)。雖然其中的關(guān)鍵參數(shù)已經(jīng)得到了優(yōu)化，但仍然無法用于實(shí)際應(yīng)用中。與小試實(shí)驗(yàn)相比，生物反應(yīng)器或生物過濾器是可對大多數(shù)工藝參數(shù)進(jìn)行良好控制的培養(yǎng)系統(tǒng)。已有一些研究對同時(shí)降解甲烷和生產(chǎn)PHB的生物反應(yīng)器進(jìn)行了設(shè)計(jì)。在序批式反應(yīng)器(SBR)和鼓泡塔生物反應(yīng)器(BCB)中Methylocystis分別達(dá)到20%～25%和40%～50%的積累量[16,41]。BCB中獲得的較高PHB含量可能是由于安裝了內(nèi)部氣體再循環(huán)系統(tǒng)，與SBR相比該系統(tǒng)可達(dá)到更高的甲烷傳質(zhì)。對生物反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可在最佳條件下獲得最大的PHA積累量。使用全因子設(shè)計(jì)對BCB合成PHB進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在甲烷：空氣比例為50∶50、初始氮源為50時(shí)，PHB積累量最大為細(xì)胞干重的42.5% (w/w)[16]。對BCB的5個(gè)工藝變量(氮源含量、磷酸氫二鈉、甲烷與空氣的比例、種齡和pH)進(jìn)行優(yōu)化，在最佳操作條件和工程參數(shù)下，干燥生物質(zhì)中的PHB含量達(dá)到25%(w/w)[42]。于BCB中高細(xì)胞密度培養(yǎng)Methylocystishirsuta，在最佳條件下PHB含量可到達(dá)73.4%(w/w)[19]。

另一方面，大多數(shù)由Ⅱ型甲烷氧化菌生產(chǎn)PHA的實(shí)驗(yàn)主要集中于使用純甲烷，很少將沼氣或天然氣等原料直接用作甲烷的來源合成PHA。研究發(fā)現(xiàn)從合成沼氣中將甲烷和CO2生物轉(zhuǎn)化為PHB和脂質(zhì)，MethylocystisparvusOBBP可獲得最大PHB含量約為30%[33]。利用Methylocystishirsuta進(jìn)一步評估了沼氣作為甲烷來源進(jìn)行PHA積累的可行性，獲得的PHB含量約為45%[43]。研究還證實(shí)了Methylocystis為優(yōu)勢菌的混合菌群利用含有痕量乙烷、丙烷和少量丁烷的管道天然氣生產(chǎn)PHB(高達(dá)42%)的可行性[44]?？上韧ㄟ^合成沼氣對甲烷氧化菌利用其合成PHA進(jìn)行研究與優(yōu)化，隨后直接使用沼氣或天然氣等原料合成PHA，并就原料中其余成分對甲烷氧化菌生長和PHA積累的影響進(jìn)行探索。

5.2 共底物的添加

不同的碳源作為共底物會對甲烷氧化菌生長性能和PHA積累量產(chǎn)生不同的影響。在Methylocystishirsuta的培養(yǎng)過程中以VFA的形式添加額外碳源，研究發(fā)現(xiàn)添加VFA不會妨礙該菌株的生長，且最大PHA產(chǎn)量和最終PHA含量分別增加至0.45～0.63 g PHA/g 底物和48%～54%[43]。添加甲醇可以提高PHA的積累量和分子量。研究不同碳源對Methylocystishirsuta合成PHB的影響，結(jié)果表明該菌株具有在各種底物上生長的能力，且使用1∶1 的甲醇∶乙醇時(shí)PHB含量最大可達(dá)到85% (w/w)[19]。適量的甲醇與甲烷共同添加可以提高M(jìn)ethylosinustrichosporiumIMW3011中積累的PHB的分子量[45]。添加甲酸可以作為替代的電子供體，有助于在甲烷缺乏的條件下維持PHA的積累水平并延緩PHA的消耗[17]。因此，可以通過提供不同濃度的不同碳源來優(yōu)化甲烷氧化菌的PHA積累能力。

不同的碳源作為共底物會對PHA的種類產(chǎn)生影響。目前PHB是生產(chǎn)最多的PHA，但工業(yè)規(guī)模的廣泛應(yīng)用要求生物聚合物具有多樣性。在過去的研究中，已發(fā)現(xiàn)可以通過在甲烷氧化菌培養(yǎng)物中添加共底物的措施來合成特定生物聚合物。添加戊酸、丙酸、戊醇等可以實(shí)現(xiàn)PHBV的合成，但其中的3-羥基戊酸酯(HV)含量有所不同。通過在培養(yǎng)液中添加戊酸使Methylocystishirsuta、MethylocystisparvusOBBP和MethylosinustrichosporiumOB3b菌株產(chǎn)生PHBV，HV的含量(20%～40%)取決于共底物的濃度[43,46-47]。丙酸和正戊醇也已成功地用于Methylocystis的PHBV生產(chǎn)中，但HV含量遠(yuǎn)低于戊酸作為共底物時(shí)的含量[47-48]。通過調(diào)節(jié)戊酸濃度和限制Cu可以增加Methylocystissp.WRRC1中的PHA和特定HV含量，最大PHA和HV含量分別為78%和>50%[48]。通過添加檸檬酸和丙酸，MethylobacteriumorganophilumCZ-2生成的聚合物包含6種不同的單體：3HB、3HV、4HV、4HH、3HO和4HO，表明了該菌合成PHA的多功能性[49]。最近研究發(fā)現(xiàn)使用ω-羥基鏈烷酸酯可由MethylocystisparvusOBBP生產(chǎn)新的特定共聚物，例如聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)(P3HB4HB)、聚(3-羥基丁酸酯-co-5-羥基戊酸酯-co-3-羥基戊酸酯)(P(3HB-co-5HV-co-3HV))或聚(3-羥基丁酸酯-co-6-羥基己酸酯-co-4-羥基丁酸酯)(P(3HB-co-6HH-co-4HB))，其表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的機(jī)械性能，分子量4.5×105～1.5×106Da[50]。 雖然這方面的研究已經(jīng)取得了上述成果，但未來的研究仍應(yīng)繼續(xù)評估新的共底物對甲烷氧化菌生長和PHA生產(chǎn)的影響。

6 結(jié)論與展望

利用甲烷氧化菌將甲烷氧化合成PHA既可以有效地減少甲烷的排放，又可以合成具有優(yōu)良特性、可廣泛應(yīng)用的生物聚合物PHA。從目前的研究來看，甲烷氧化菌將甲烷作為電子供體可獲得一定量的PHA積累。許多因素會對甲烷氧化菌的PHA積累能力產(chǎn)生影響，但影響效果會因菌種的不同而發(fā)生變化。大多數(shù)研究報(bào)道仍在針對小試實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，對更大的生物反應(yīng)器系統(tǒng)性能和運(yùn)行狀況研究較少。因此，盡管甲烷氧化菌利用甲烷合成PHA具有較大潛力，但進(jìn)一步研究仍需做到：(1)開發(fā)新型生物反應(yīng)器配制和運(yùn)行策略，以同時(shí)增加甲烷的去除率和生物量生產(chǎn)率；(2)在營養(yǎng)限制條件下，通過添加共底物來合成特定生物聚合物，以優(yōu)化PHA的生產(chǎn)；(3)了解不同環(huán)境因素產(chǎn)生作用的機(jī)理和動力學(xué)，建立模型進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)條件，以獲得PHA積累最大化。