尹業(yè)鑫 王 芳 余東明 王 鑫 符晨星 陳家順，2*

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)基因組與種質創(chuàng)新研究中心，長沙 2410128；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 2410125)

隨著畜牧業(yè)集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，為減少畜禽疾病的發(fā)生，抗生素被大批量使用?？股仉m然能起到殺菌，提高機體免疫力、暫時降低疾病的發(fā)生率等作用，但同時也導致了細菌耐藥性和藥物殘留等問題。因此，世界各地已限制使用抗生素，在我國，2019年農業(yè)農村部發(fā)布第194號公告，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。因此，開發(fā)健康、無污染的綠色抗生素替代物迫在眉睫。枸杞是我國傳統(tǒng)的中藥材，富含多糖、蛋白質、維生素等營養(yǎng)成分，其中枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)具有調節(jié)免疫[1-2]、抗癌[3]、抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]及護肝[8-10]等多種藥理學功能，具有開發(fā)成抗生素替代物的潛力，其在養(yǎng)殖業(yè)中的應用備受關注。譚連杰等[11]研究表明，在飼料中添加1 g/kg LBP可以提高卵形鯧鲹的抗氧化能力及免疫能力。Liu等[12]研究表明，在飼糧中添加4 g/kg LBP可以調節(jié)淋巴細胞增殖和炎性細胞因子的表達，提高21日齡肉雞免疫器官指數，促進肉雞的生長性能。Long等[13]研究表明，在飼糧中添加2 g/kg LBP可以增強肉雞消化酶活性、抗氧化能力、免疫力，進而提高其生長性能。目前，關于LBP對動物腸道健康的影響至今尚未明確。鑒于此，本試驗擬以斷奶大鼠為研究對象，通過在飼糧中添加LBP，探究其對生長性能、抗氧化能力、腸黏膜免疫功能及腸道形態(tài)結構的影響，以期為LBP應用于畜牧生產，改善動物腸道健康、促進動物生長提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LBP有效含量為60%，購自于陜西某生物制品有限公司。

1.2 試驗設計

選取體重接近的健康雄性SD大鼠(4周齡)20只，按體重接近的原則隨機分成2組(每組10個重復，每個重復1只)，分別飼喂基礎飼糧(對照組)和在基礎飼糧中添加4 g/kg LBP的試驗飼糧(LBP組)，試驗期為28 d?；A飼糧參考AIN-93G大鼠純化飼養(yǎng)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。飼養(yǎng)試驗在湖南農業(yè)大學動物科學教學科研基地完成，試驗大鼠采用單籠飼養(yǎng)，采用自由飲食、自然采光等常規(guī)飼養(yǎng)管理。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content粗脂肪 Crude fat6.00碳水化合物 Carbohydrate64.65

1.3 樣品采集

對全部大鼠依次進行眼球摘除采血。采集的血樣靜置30 min后，4 ℃下4 000 r/min離心15 min制備血清，-80 ℃保存。采血后將大鼠處死并解剖，分離并取空腸腸段3 cm置于4%甲醛溶液中固定；取空腸黏膜，液氮暫存，之后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能

每只大鼠作為1個單位。試驗第1天對大鼠進行稱重，作為初始體重；第28天進行第2次稱重，作為終末體重。記錄每次飼喂量及最后剩料重，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

1.4.2 空腸黏膜和血清中抗氧化指標

參考湯俊等[14]的方法對組織樣品進行前處理?？漳c黏膜和血清中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量均采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒進行測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.4.3 空腸形態(tài)結構

取出4%甲醛溶液固定的腸道組織，經常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后[15]，利用Motic Images Advanced 3.2軟件，測量空腸黏膜隱窩深度和絨毛高度，每張切片觀察10個視野。計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.4.4 空腸黏膜細胞因子含量

空腸黏膜中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-10(IL-10)含量均采用ELISA試劑盒進行測定，試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.4.5 空腸黏膜免疫球蛋白含量

空腸黏膜中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白(IgM)含量均采用ELISA試劑盒進行測定，試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟參考試劑盒說明書。

1.5 數據處理與分析

試驗數據用Excel 2013進行初步處理，然后用軟件SPSS 20.0進行t檢驗，P<0.05為差異顯著。數據以“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，LBP組ADG提高了16.3%(P<0.05)，ADFI與F/G無顯著變化(P>0.05)。

表2 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠生長性能的影響

2.2 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜和血清中抗氧化指標的影響

由表3可知，與對照組相比，LBP組血清中T-AOC與GSH-Px活性分別提高了52.8%(P<0.05)和67.5%(P<0.05)，MDA含量降低了31.7%(P<0.05)；LBP組空腸黏膜中T-AOC提高了99.1%(P<0.05)，MDA含量降低了13.7%(P<0.05)，GSH-Px活性無顯著變化(P>0.05)。

表3 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜和血清中抗氧化指標的影響

2.3 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸形態(tài)結構的影響

由表4可知，與對照組相比，LBP組空腸的絨毛高度與隱窩深度無顯著變化(P>0.05)，但V/C提升了21.4%(P<0.05)。

表4 飼糧添加LBP對斷奶大鼠空腸形態(tài)結構的影響

2.4 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜中細胞因子含量的影響

由表5可知，與對照組相比，LBP組空腸黏膜中IL-2與IL-10含量分別上升了31.6%(P<0.05)和66.0%(P<0.05)，IL-6含量無顯著變化(P>0.05)。

表5 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜中細胞因子含量的影響

2.5 飼糧中添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜中免疫球蛋白含量的影響

由表6可知，與對照組相比，LBP組空腸黏膜中IgA與IgG含量分別提升了33.7%(P<0.05)和35.1%(P<0.05)，IgM含量無顯著變化(P>0.05)。

表6 飼糧添加LBP對斷奶大鼠空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

動物生長性能是實際生產中關注的焦點之一，一般從試驗動物的ADG與F/G中體現，反映動物生長發(fā)育情況。近年來，大量研究表明，LBP可提高斷奶仔豬[16]、肉仔雞[17]、育肥羊[18]等動物的生長性能。本試驗中，飼糧中添加LBP顯著提高了斷奶大鼠的ADG，表明LBP提高了斷奶大鼠的生長性能，與前人的研究結果一致，其促生長作用的原因可能是：1)LBP可改善機體腸道黏膜形態(tài)結構的完整性，促進腸道對營養(yǎng)物質的消化與吸收[19]；2)LBP可增加腸道抗氧化物酶的活性，清除氧自由基，改善氧化應激狀態(tài)，提高組織抗氧化能力[20-21]；3)LBP可以提高腸道的免疫性能，促進免疫細胞分化增殖及細胞因子的合成分泌[22]。

腸道對于維持和改善機體健康至關重要，其中，腸道的抗氧化功能與維持腸道健康息息相關。MDA作為脂質過氧化的產物之一，其含量可以反映機體的氧化水平和自由基攻擊的程度[23]。對應的，機體內會有抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、GSH-Px等，它們互相協(xié)作使自由基在體內處于動態(tài)平衡，其活性可以反映機體清除自由基的能力。Wu等[24]研究表明，給小鼠進行LBP灌喂干預后，能夠清除其體內的氧自由基，防止脂質過氧化，有效提高組織抗氧化能力。Yang等[25]研究發(fā)現，LBP能抑制多形核中性粒細胞(PMN)的積累和細胞內黏附分子-1(ICAM-1)的表達，增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，活化核因子(NF)-κB，引起腸道通透性和組織學變化，提高抗氧化酶活性，減少腸道氧化損傷。Ren等[26]研究發(fā)現，LBP可以提高腸道對營養(yǎng)物質的吸收。本試驗結果表明，飼糧中添加LBP可提高斷奶大鼠空腸黏膜與血清中T-AOC及血清GSH-Px活性，降低空腸黏膜與血清中MDA含量，能夠有效清除自由基，抑制脂質過氧化，提高斷奶大鼠機體的抗氧化能力。因此，LBP可能是通過增強機體抗氧化酶的活性，減少腸道氧化損傷，提高腸道對營養(yǎng)物質的吸收，進而改善動物的生長性能。

腸道黏膜的免疫系統(tǒng)可以防止細菌或者病毒等微生物入侵影響腸道健康，是機體的第1道防線。而腸道黏膜的免疫功能主要是免疫細胞和細胞因子在發(fā)揮作用。其中，IL-2具有刺激B淋巴細胞增殖并產生抗體，促進T淋巴細胞、NK細胞產生細胞因子等功能[27]；IL-6能夠使效應B淋巴細胞及T淋巴細胞發(fā)生增殖，活化CTL并可以參與炎癥反應[28]；IL-10可促進B細胞分化增殖。細胞免疫和體液免疫主要通過T淋巴細胞和B淋巴細胞來發(fā)揮作用的。淋巴細胞增殖對免疫應答至關重要[29]。Tan等[30]研究表明，枸杞提取物可降低飼喂高脂飼料石斑魚肝臟中白細胞介素-8(IL-8)含量，提高IL-10含量，增加肝臟抗氧化酶活性及其基因表達，抑制肝臟炎癥反應和凋亡，改善其生長性能。此外，促炎細胞因子為合成免疫效應分子會促進分解代謝[31]，因此，其分泌對機體是不利的。Li[32]研究表明，LBP可以增加大鼠血清中IL-2與白細胞介素-12(IL-12)含量。本試驗結果顯示，在飼糧中添加LBP可顯著提高斷奶大鼠空腸黏膜中IL-2與IL-10的含量，但是對IL-6含量無顯著影響，這與Liu等[12]的研究結果一致。由以上論述推斷，LBP可能是通過調節(jié)炎性細胞因子的表達來刺激免疫細胞的增殖分化，提高機體免疫力，進而促進動物的生長性能。

免疫球蛋白指具有抗體活性的動物蛋白，可以分為IgG、IgA、IgM、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)等5類，能夠增強單核巨噬細胞的吞噬作用，減弱細菌毒素的毒性，激活補體，對病毒等微生物具有抗體活性，能夠抑制它們繁殖，進而減少其附著在腸道黏膜上[33-35]。Li等[36]研究表明，在飼糧中添加蒼術多糖可提高斷奶仔豬血清中IgG和IgM含量。本試驗結果表明，在飼糧中添加LBP可顯著提高斷奶大鼠空腸黏膜中IgA與IgG含量，這與前人的研究結果[37]一致。由此可見，LBP可以通過調節(jié)腸道黏膜免疫球蛋白的含量，增強抗體活性，減弱細菌毒素的毒性來增強機體的免疫功能，進而改善動物的生長性能。

在腸道物理屏障功能中腸道形態(tài)結構扮演著重要角色，并且影響腸道對營養(yǎng)物質的消化與吸收[38-39]，而其完整性主要是由絨毛高度、隱窩深度及V/C等指標體現的。王園等[40]研究表明，在斷奶大鼠飼糧中添加發(fā)酵麩皮多糖后可以提高其空腸絨毛高度和V/C。本試驗探討了LBP對斷奶大鼠腸道形態(tài)結構的影響，結果表明，在飼糧中添加LBP可提高斷奶大鼠空腸絨毛高度與V/C，降低其隱窩深度。由此可見，在飼糧中添加LBP在一定程度上可以改善斷奶大鼠腸道形態(tài)結構的完整性，增強其腸道物理屏障功能，進而達到提高生長性能的效果。

4 結 論

飼糧中添加4 g/kg LBP可顯著提高斷奶大鼠的ADG，空腸黏膜與血清中T-AOC及血清中GSH-Px活性，以及空腸黏膜中IL-2、IL-10、IgA與IgG的含量，并可顯著提高空腸V/C。由此可見，飼糧中添加LBP可以提高斷奶大鼠的抗氧化能力及腸黏膜免疫功能，改善腸道形態(tài)結構，進而提高生長性能。