陸 江 朱道仙 劉 莉* 郝福星 吳 植 盧勁曄 盧 煒 劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，泰州 2225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，泰州 2225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，泰州 2225300)

隨著人們生活水平的提高，伴侶動物犬也逐漸成為許多家庭中的一員。但因為不良的行為及飲食，導(dǎo)致犬能量過剩，使得肥胖癥成為犬的常見疾病[1]。幸運的是，寵物飼養(yǎng)者已意識到肥胖給犬帶來的健康問題，寵物減肥也成為寵物界關(guān)注的熱點。飲食干預(yù)由于經(jīng)濟實惠、操作簡便及無任何副作用等優(yōu)點已逐漸成為寵物減肥產(chǎn)品開發(fā)的新趨勢。高蛋白質(zhì)飲食干預(yù)對肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要意義[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者與瘦者的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)有顯著差異，肥胖患者有更強的發(fā)酵碳水化合物的能力[3]。肥胖患者中腸道菌群的組成與脂肪組織褐變和胰島素作用相關(guān)，可能通過其代謝產(chǎn)物SCFAs發(fā)揮作用[4]，說明腸道菌群及SCFAs在肥胖癥進程中起重要作用。然而，有關(guān)高蛋白質(zhì)飲食對肥胖犬腸道菌群及SCFAs影響的報道甚少。因此，本研究比較不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬糞便SCFAs濃度及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，探究高蛋白質(zhì)飼糧對肥胖犬減重的可能新機制，為寵物減肥產(chǎn)品開發(fā)提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

肥胖型拉布拉多獵犬，(5±1)歲，雄性，由江蘇省寵物繁育中心提供。肥胖型拉布拉多獵犬納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：通過雙能X線骨密度檢測儀(型號XR-600，美國Norland公司)檢測體脂率，體脂率>34%者視為肥胖。

1.2 試驗設(shè)計

選取30只肥胖型拉布拉多獵犬，隨機等分為3組：低蛋白質(zhì)組(LP組)、中蛋白質(zhì)組(MP組)和

高蛋白質(zhì)組(HP組)。所有犬均以商品化成年犬糧(冠能大型成年犬犬糧，規(guī)格12 kg/袋，雀巢普瑞納寵物食品有限公司產(chǎn)品，粗蛋白質(zhì)含量≥26%)進行15 d適應(yīng)性飼喂。然后LP組、MP組和HP組分別飼喂含20.58%(低蛋白質(zhì)飼糧)、27.77%(中蛋白質(zhì)飼糧)和39.04%(高蛋白質(zhì)飼糧)粗蛋白質(zhì)的飼糧，試驗期為45 d。整個試驗過程中，所有犬均單籠飼養(yǎng)，每天09：00及16：00各喂食1次，進食時間為5 min，并且所有犬每天均在寵物訓(xùn)練場自由活動15 min左右。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 體況指標(biāo)測定

分別于試驗開始和結(jié)束時用電子稱稱量各個試驗犬空腹體重，同時用雙能X線骨密度檢測儀測定體脂率。

1.4 血清生化指標(biāo)測定

分別于試驗開始和結(jié)束時空腹經(jīng)頭靜脈采集各個試驗犬的血液，3 000 r/min離心5 min得到血清。采血當(dāng)天用試劑盒法測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量，試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司；用Catalyst Dx動物生化分析儀(美國愛德士生物科技公司)測定血清尿素氮(UN)和肌酐(Cr)含量。

1.5 糞便樣本采集及糞便SCFAs濃度測定

分別于試驗開始和結(jié)束時無菌收集直腸中糞便，分為2份，分別放入10 mL凍存管并迅速放入液氮中保存。一份用于檢測SCFAs濃度，另一份用于腸道菌群16S rDNA高通量測序。樣品采集完畢后立即轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

糞便中SCFAs濃度的測定采用氣相色譜法(Agilent 6890N氣相色譜儀，美國)。準(zhǔn)確稱取1 g樣品，加4 mL超純水，振蕩混勻30 min后，12 000 r/min將上清液轉(zhuǎn)移，重復(fù)以上步驟1次，合并上清液并定容到10 mL離心管中。取4.5 mL上清液，按9∶1體積比在樣品中加入25%偏磷酸，固定3 h以上，然后12 000 r/min離心10 min，45 μm濾膜過濾加入上機瓶。色譜條件：采用DB-1 ms毛細(xì)管柱進行分離，載氣為氮氣，流量為1 mL/min，輔助氣為氫氣，火焰離子檢測器(FID)溫度280 ℃，分流比50∶1，進樣量2 μL。色譜程序升溫步驟如下：初始溫度40 ℃，接著以5 ℃/min的速度升至70 ℃，維持3 min，再以20 ℃/min的速度升至160 ℃，維持3 min，最后以35 ℃/min的速度升至280 ℃，維持3 min。

1.6 腸道菌群16S rDNA高通量測序

1.6.1 糞便總DNA提取與PCR

稱取無菌糞便樣品100 mg，采用Qiagen DNA試劑盒按說明書提取總DNA，再以獲得的細(xì)菌DNA為模板對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，上游引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物序列為5′-GGACTACGCGGGTATCTAAT-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，6個循環(huán)；92 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；然后72 ℃擴展延伸10 min，4 ℃保存。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對所得PCR產(chǎn)物進行純化后，用于后續(xù)操作。

1.6.2 Illumina高通量測序及處理

1.6.3 生物信息分析

用QIIME(version 1.9.1)[7]分析腸道菌群α多樣性，用基于weighted UniFrac matrices的主坐標(biāo)分析(PCoA)進行β多樣性分析[8]，用STAMP分析組間差異菌群[9]，用PICRUSt預(yù)測菌群基因組功能[10]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

計量資料用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和組間兩兩比較，組內(nèi)試驗開始和結(jié)束時的差異比較采用配對t檢驗，腸道菌群豐度比較采用Kruskal-Wallis檢驗，用Pearson法分析相關(guān)性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬體重及體脂率的影響

從表2可以看出，試驗開始時各組犬的體重及體脂率均無顯著差異(P>0.05)；試驗結(jié)束時HP組犬體重及體脂率均低于MP組和LP組(P<0.05)，同時MP組也顯著低于LP組(P<0.05)。與試驗開始時相比，試驗結(jié)束時HP組犬的體重(P=0.047)及體脂率(P=0.012)顯著降低，LP組和MP組的體重及體脂率則無顯著變化(P>0.05)。

表2 體重及體脂率的變化

2.2 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，試驗開始時各組犬的血清生化指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)；試驗結(jié)束時HP組犬的血清TG、TC及LDL含量均顯著低于MP組和LP組(P<0.05)，同時MP組也顯著低于LP組(P<0.05)，其他血清生化指標(biāo)在3組間無顯著差異(P>0.05)。與試驗開始時相比，HP組犬血清LDL含量極顯著降低(P=0.001)，血清TG含量顯著降低(P=0.041)，血清UN含量極顯著升高(P=0.002)，MP組和LP組各血清生化指標(biāo)則無顯著變化(P>0.05)。

表3 血清生化指標(biāo)的變化

2.3 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬糞便中SCFAs濃度的影響

由圖1可知，試驗結(jié)束時HP組糞便中乙酸濃度極顯著低于試驗開始時(P<0.01)，且極顯著低于同期LP組和MP組(P<0.01，圖1-a)；無論是試驗開始時還是結(jié)束時，各組間丙酸濃度均無顯著變化(P>0.05，圖1-b)；試驗結(jié)束時HP組糞便中丁酸濃度顯著高于試驗開始時(P<0.05)，且顯著低于同期LP組和MP組(P<0.05，圖1-c)；試驗結(jié)束時HP組糞便中總SCFAs濃度顯著低于試驗開始時(P<0.05)，且顯著低于同期LP組和MP組(P<0.05，圖1-d)。體脂率與糞便中總SCFAs(r=0.389)和乙酸濃度(r=0.752)呈正相關(guān)關(guān)系(圖1-e、圖1-f)，與糞便中丁酸濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.395，圖1-g)。

P1：試驗開始；P2：試驗結(jié)束。LP：LP組；MP：MP組；HP：HP組?！癮”表示兩組間差異顯著(P<0.05)，“aa”表示兩組間差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.4 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬腸道菌群多樣性的影響

觀察物種數(shù)、Chao1指數(shù)及Simpson指數(shù)是反映腸道菌群ɑ多樣性的主要指標(biāo)。腸道菌群觀察物種數(shù)、Chao1指數(shù)無論是組內(nèi)試驗開始與結(jié)束時比較還是同期組間比較均無顯著差異(P>0.05，圖2-a、圖2-b)；試驗結(jié)束時HP組腸道菌群Simpson指數(shù)顯著高于試驗開始時以及同期LP組和MP組(P<0.05，圖2-c)。PCoA是反映腸道菌群β多樣性的指標(biāo)，可直觀顯示不同組間微生物進化上的相似性及差異性，距離越近相似性越高，距離越遠(yuǎn)差異性越大。試驗開始時，3組樣本間距離較近，主坐標(biāo)成分1(PCo1)可以解釋最大51.48%數(shù)據(jù)變化，說明各組犬腸道菌群在試驗開始具有相似性(圖2-d)；試驗結(jié)束時，HP組樣本遠(yuǎn)離LP組和MP組樣本，說明HP組腸道菌群與LP組、MP組有差異(圖2-e)。

圖2 腸道菌群多樣性的變化

2.5 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬腸道菌群組成的影響及差異菌屬分析

在門水平，各組犬腸道優(yōu)勢菌群主要分布在5個門，分別是厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、變形菌門和放線菌門(圖3-a)。試驗結(jié)束時，與LP組、MP組比較，HP組擬桿菌門相對豐度顯著降低(P<0.05，圖3-c)，厚壁菌門相對豐度顯著升高(P<0.05，圖3-d)，擬桿菌門/厚壁菌門比值顯著降低(P<0.05，圖3-e)。在科水平，梭桿菌科、擬桿菌科、普雷沃菌科等相對豐度較高，為各組犬腸道優(yōu)勢菌群(圖3-b)。在屬水平，HP組梭菌屬、瘤胃球菌屬、普拉梭菌屬及漫游球菌屬相對豐度極顯著高于LP組(P<0.01，圖4-a)，梭菌屬、多爾氏菌屬、瘤胃球菌屬、普拉梭菌屬及擬桿菌屬相對豐度極顯著高于MP組(P<0.01，圖4-b)；MP組普拉梭菌屬、別樣棒菌屬及普雷沃菌群相對豐度極顯著高于LP組(P<0.01，圖4-c)。

圖3 腸道菌群在門水平和科水平的組成

圖4 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬腸道菌屬的影響

2.6 腸道菌群基因功能預(yù)測分析

圖5 腸道菌群基因功能預(yù)測分析(KEGG通路第3層級)

3 討 論

遺傳因素和飲食模式是影響動物肥胖癥發(fā)生發(fā)展的兩大重要因素?，F(xiàn)階段，已有多種飲食干預(yù)方法用于超重和肥胖的治療，如高蛋白質(zhì)飲食。王雙等[11]通過為期4周的短期高蛋白質(zhì)飲食干預(yù)發(fā)現(xiàn)，受試者體重和體脂率均有所降低，且對肥胖患者血液中TG、LDL含量的改善效果更好。劉闖[12]研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飼糧有助于降低高脂誘導(dǎo)肥胖SD大鼠體脂率。在本研究中，飼喂高蛋白質(zhì)飼糧肥胖犬在試驗結(jié)束時的體重、體脂率以及血清中TG與LDL含量均低于LP組、MP組及自身試驗開始時，說明高蛋白質(zhì)飼糧對肥胖犬具有減重效果，與上述報道結(jié)論相一致。此外，高蛋白質(zhì)飼糧對肥胖犬血清Cr含量無顯著影響，僅血清UN含量輕度升高，這可能與蛋白質(zhì)攝入有關(guān)。

SCFAs是由回腸末端和結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，約95%的SCFAs經(jīng)結(jié)腸吸收入血液循環(huán)，然后代謝為機體提供5%～10%的能量[13]。其中，丁酸被結(jié)腸上皮細(xì)胞利用作為其主要能量來源；丙酸則被吸收運送至肝臟進行糖、脂代謝，并且能夠抑制膽固醇的合成；乙酸經(jīng)血液循環(huán)進入肝臟代謝為乙酰輔酶A，是脂肪與膽固醇合成重要的底物[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖兒童糞便SCFAs的濃度比體重正常的人高[15]，動物試驗也表明肥胖鼠相比正常鼠糞便中SCFAs濃度更高[16]，尤其是高濃度的乙酸，可激活副交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進胰島素、胃饑餓素的分泌，進而引起食欲過盛、肥胖和相關(guān)后遺癥[17]。也有研究表明，丁酸可以刺激胰腺分泌[18]，增加胰高血糖素和胰島素水平，提高胰島素敏感性，從而改善糖、脂代謝，減少脂肪堆積。在肥胖小鼠模型中，口服丁酸鹽可有效預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥和肝臟脂肪變性等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖犬體脂率與糞便中總SCFAs、乙酸濃度呈正相關(guān)，與丁酸濃度呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)論相一致，提示SCFAs與犬肥胖有密切關(guān)系。高蛋白質(zhì)飼糧可以降低肥胖犬糞便中總SCFAs及乙酸濃度，提高丁酸濃度。

動物胃腸道內(nèi)有大量微生物，特別是結(jié)腸部位，微生物豐度最高，特定腸道微生物的代謝活動可能對動物的消化吸收、體重變化及一系列生理過程產(chǎn)生重要影響[20-21]。糞便菌群與結(jié)腸中菌群組成相似[22]，且糞便樣本易采集，因此通過糞便中菌群結(jié)構(gòu)來反映腸道菌群結(jié)構(gòu)是許多研究人員選用的方法[23]。本研究通過檢測糞便中菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)高蛋白質(zhì)飼糧未能改變肥胖犬腸道菌群的豐富度，但提高了腸道菌群的均勻度，與楊鳳嘯等[24]研究得出的高脂飼糧誘導(dǎo)肥胖小鼠腸道菌群多樣性降低的結(jié)論相似。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質(zhì)水平飼糧對肥胖犬在門水平的核心菌群組成影響不大，但菌群豐度發(fā)生改變，HP組厚壁菌門的相對豐度增加，擬桿菌門的相對豐度降低，擬桿菌門/厚壁菌門比值降低，這種變化可促進體重減輕[6]。在屬水平，梭菌屬及普拉梭菌屬等細(xì)菌主要富集在HP組。梭菌屬具有較強的產(chǎn)丁酸能力[25]，這可能也是HP組糞便中丁酸濃度升高的主要原因，普拉梭菌屬有改善肥胖的作用[26]。腸道菌群基因功能分析發(fā)現(xiàn)，HP組的黃酮和黃酮醇生物合成、色氨酸代謝及檸檬烯和蒎烯降解等第3層級KEGG通路上調(diào)，而這些通路均與機體脂肪代謝有關(guān)[27]。

4 結(jié) 論

高蛋白質(zhì)飼糧可改善肥胖犬腸道菌群結(jié)構(gòu)及短鏈脂肪酸代謝，有減重降脂作用。