熊云鳳 吳佳文 周東生 鄭金仙 邱 恬 李秋琳 孔有琴 邵仙萍 葉金云 丁志麗

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 2313000)

在目前的水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展中，集約化養(yǎng)殖因其占地少、工業(yè)化、效益高等優(yōu)勢(shì)，受到越來越多養(yǎng)殖戶的喜愛。但由于在集約化養(yǎng)殖中水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求基本依靠投喂人工飼料來滿足，所以水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料的營(yíng)養(yǎng)需求也隨水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展而提高。如果飼料營(yíng)養(yǎng)不合理，再加上集約化養(yǎng)殖的高密度脅迫[1]，必然會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和非特異性免疫等方面帶來不利影響，從而降低水產(chǎn)動(dòng)物的質(zhì)量[2]。因此，尋求優(yōu)質(zhì)的功能性飼料添加劑對(duì)維持水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、健康和正常的生理功能十分重要。

酵母水解物(yeast hydrolyzate，YH)是酵母細(xì)胞經(jīng)酸性酶解或其他水解方法得到的產(chǎn)物[3]，因其含有的大量的β-葡聚糖、核酸、核苷酸、小肽、游離氨基酸和豐富的B族維生素[4-5]，可作為水產(chǎn)動(dòng)物一種重要的功能性添加劑。研究發(fā)現(xiàn)，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中添加酵母水解物，有利于提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力[6-9]。Jin等[6]對(duì)南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的研究表明，飼料中添加10 g/kg的酵母水解物可以促進(jìn)蝦的生長(zhǎng)，提高非特異性免疫性能，增強(qiáng)對(duì)氨氮的抵抗力。Mohsen等[7]對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究表明，飼料中添加1、2和5 g/kg酵母產(chǎn)品可以提高魚的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)沉積，增強(qiáng)對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力。Zhang等[8]對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的研究表明，飼料中添加5 g/kg的酵母水解物可以增加可食內(nèi)臟指數(shù)，提高抗氧化能力和非特異免疫性能。柳茜等[9]對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚的研究表明，飼料中添加2%酵母水解物可提高其機(jī)體免疫能力、肝臟抗氧化性能和抗應(yīng)激能力。

眾所周知，腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收?qǐng)鏊覍?duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有重要作用[10]，而穩(wěn)定的腸道菌群對(duì)宿主的健康至關(guān)重要[11]。在魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物能夠幫助魚類抵抗養(yǎng)殖密度和攝食的變化[12]，這一發(fā)現(xiàn)為高密度集約化養(yǎng)殖提供了突破點(diǎn)。而含有酵母水解物的飼料pH一般偏低，能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌群的生長(zhǎng)，從而提高飼料的利用率和消化率[10-11，13]。目前，有關(guān)酵母水解物所含成分對(duì)腸道菌群的作用已有相關(guān)研究。如在對(duì)塞內(nèi)加爾鰨米魚(Soleasenegalensis)的研究中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用酵母β-葡聚糖可以調(diào)節(jié)魚的免疫性能，控制腸道內(nèi)弧菌的增殖[13]。但有關(guān)酵母水解物本身對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群的研究報(bào)道較少，因此加強(qiáng)酵母水解物對(duì)經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群的作用具有重要意義。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)由于味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖成本相對(duì)較低，深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛，是一種重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種。但日本沼蝦對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的應(yīng)激極為敏感[14-16]，通過營(yíng)養(yǎng)來提高其抗應(yīng)激能力簡(jiǎn)單易行[17]。鑒于酵母水解物在提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)免疫等方面具有重要的生理功能，本研究擬在日本沼蝦基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的酵母水解物，分析酵母水解物對(duì)日本沼蝦幼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、非特異性免疫和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及飼料

試驗(yàn)所用的酵母水解物源自浙江某生物科技股份有限公司的啤酒酵母泥，其粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分和水分的含量分別為45.80%、2.88%、0.74%、6.60%和4.50%，無氮浸出物含量為39.48%，氨基酸態(tài)氮含量為2.10%，酸溶蛋白質(zhì)含量為32.80%，β-葡聚糖含量為22.6%，甘露聚糖含量為9.87%，游離氨基酸含量總和為12.30%。

以豆粕、菜籽粕和魚粉為蛋白質(zhì)源，魚油和豆油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料(YH1)之上，分別添加0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的酵母水解物配制4種試驗(yàn)飼料，并分別命名為YH2、YH3、YH4和YH5。將表1中的固態(tài)原料粉碎后過60目篩，按配方逐一準(zhǔn)確稱量(魚油和豆油最后加入)，混合均勻后，使用F-26雙螺旋擠條機(jī)(華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠制造)制成直徑1.5 mm的顆粒飼料，用烘箱在溫度不超過50 ℃條件下烘干，常溫冷卻，裝袋標(biāo)注后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)中所用日本沼蝦購(gòu)于當(dāng)?shù)啬趁绶N培育場(chǎng)。在養(yǎng)殖試驗(yàn)之前，對(duì)養(yǎng)殖使用的所有器具進(jìn)行清洗和消毒處理，再在每個(gè)白水槽(塑膠材質(zhì)，300 L)中放置一定量的藍(lán)色水管和網(wǎng)片作為蝦的隱藏地，以減少蝦蛻殼時(shí)遭到攻擊和爭(zhēng)奪飼料而產(chǎn)生的傷亡。先將蝦放置于暫養(yǎng)桶中以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周，使其適應(yīng)試驗(yàn)條件。隨后選擇健康、大小均勻、初始體重為(0.104±0.003) g的1 000尾日本沼蝦幼蝦，隨機(jī)放入20個(gè)白水槽中，每組4個(gè)平行，每平行(箱)50尾蝦。每天換水1次，換水量為水體的1/3；每日分2次(08：00和17：00)定時(shí)飽食投喂，以剛好吃完為準(zhǔn)；每日16：00觀察試驗(yàn)蝦狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)死蝦數(shù)目。在自然光周期下，水溫保持在25～28 ℃，水體中溶解氧含量>6.5 mg/L、氨和硝酸鹽含量<0.1 mg/L，pH 7.6～8.1，靜水養(yǎng)殖8周。

1.3 樣品采集

在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h。撈取每箱全部的蝦，分別記錄尾數(shù)并稱重。在無菌條件下，從YH1、YH3和YH5組的每個(gè)平行取10只左右的日本沼蝦腸道，用于腸道菌群分析。取出5只蝦完整的肝胰腺，將肝胰腺與腸道分別裝管標(biāo)記后保存于-80 ℃超低溫冰箱，以供后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定及分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 飼料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

水分含量采用失重法(105 ℃烘干至恒重)測(cè)定；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(Kjeltec-8200， FOSS， 丹麥)測(cè)定；粗脂肪含量使用索氏抽提法測(cè)定，乙醚(化學(xué)純)為抽提液。

1.4.2 生長(zhǎng)性能的測(cè)定與計(jì)算

成活率(survival rate， SR， %)=
100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；
增重率(weight gain rate， WGR， %)=100×

(終末體重-初始體重)/初始體重；
特定生長(zhǎng)率(specific growth rate， SGR， %/d)=
100×(ln終末體重-ln初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4.3 免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

通過測(cè)定蝦肝胰腺組織中一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性，以確定酵母水解物對(duì)日本沼蝦免疫性能的影響；同時(shí)通過測(cè)定肝胰腺中丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，以判定酵母水解物對(duì)日本沼蝦抗氧化能力的影響。免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒經(jīng)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo， Multiskan GO 1510)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 腸道菌群的測(cè)定

采集3組(YH1、YH3和YH5組，每組3個(gè)平行)腸道及其內(nèi)容物，經(jīng)提取DNA后，送至上海元莘公司，采用Illumina高通量測(cè)序和16S核糖體RNA基因的測(cè)序結(jié)果對(duì)日本沼蝦的腸道菌群進(jìn)行分析。具體過程參照鄭純純等[18]方法進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果已上傳至NCBI，SRA登錄號(hào)為SRR12400126-12400134。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若組間差異顯著，再用Tukey氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母水解物對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，成活率不受飼料中酵母水解物添加水平的影響(P>0.05)，但呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)，在YH4組中成活率達(dá)到最高；當(dāng)飼料中酵母水解物添加水平為1.0%(YH3組)時(shí)，日本沼蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率達(dá)到最高，且顯著高于YH1組(P<0.05)。

表2 酵母水解物對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 酵母水解物對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，相比YH1組，YH3、YH4和YH5組的肝胰腺M(fèi)DA含量顯著降低(P<0.05)，并在YH3組達(dá)到最低；與MDA含量結(jié)果相應(yīng)，肝胰腺T-AOC結(jié)果顯示，YH2、YH3和YH4組顯著高于YH1和YH5組(P<0.05)，在YH3組達(dá)到最高；肝胰腺SOD活性隨著酵母水解物的添加水平提高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，YH2、YH3和YH4組的肝胰腺SOD活性也高于其余2組，其中，YH4組顯著高于YH1組(P<0.05)；YH5組的肝胰腺GSH-Px活性顯著低于其余各組(P<0.05)。

表3 酵母水解物對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 酵母水解物對(duì)日本沼蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，酵母水解物添加水平可影響肝胰腺NO含量和NOS活性，在YH5組顯著高于其余各組(P<0.05)。

表4 酵母水解物對(duì)日本沼蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

2.4 酵母水解物對(duì)日本沼蝦腸道菌群多樣性的影響

由表5可知，3個(gè)組的高質(zhì)量序列總數(shù)為254 739條，平均每個(gè)樣本有84 913條序列。每組的覆蓋率超過99.9%，表明這些群體中的16S rRNA基因序列代表了本研究樣本中存在的大多數(shù)細(xì)菌。各組間序列數(shù)(Reads)、操作分類單元(OTUs)、菌群豐度(Chao指數(shù))和多樣性(Simpson指數(shù))都無顯著差異(P>0.05)。但Shannon指數(shù)組間出現(xiàn)顯著差異，YH3組顯著低于YH1組(P<0.05)，繼續(xù)增加酵母水解物添加水平，Shannon指數(shù)又得到回升。

表5 酵母水解物對(duì)日本沼蝦腸道菌群的α多樣性的影響

在圖1中根據(jù)unweight-UniFrac距離，用主坐標(biāo)分析(PCoA)圖顯示在不同酵母水解物添加水平下日本沼蝦腸道菌群組成。從圖可知，在主成分3(PC3)水平上各組未因酵母水解物添加水平不同而出現(xiàn)分離；但在主成分1(PC1)水平上添加了酵母水解物的YH3、YH5組與YH1組之間出現(xiàn)了明顯分離。

YH1-1、YH1-2和YH1-3表示YH1組；YH3-1、YH3-2和YH3-3表示YH3組；YH5-1、YH5-2和YH5-3表示YH5組。圖3同。

如圖2所示，抽平后3組共留下1 391個(gè)OTUs，其中各組日本沼蝦腸道菌群共同具有342個(gè)OTUs。YH1、YH3、YH5組的OTUs數(shù)分別為404、153和209個(gè)。

YH1表示YH1組；YH3表示YH3組；YH5表示YH5組。

圖3以門為水平分類，發(fā)現(xiàn)了8種優(yōu)勢(shì)菌門，即：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、衣原體門(Chlamydiae)和浮霉菌門(Planctomycetes)。在這3組中，各組這8種優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度分別為：YH1組68.20%、3.18%、0.28%、5.05%、9.48%、4.73%、0.71%、1.78%；YH3組66.34%、24.09%、0.18%、4.19%、0.43%、1.78%、1.90%、0.43%；YH5組49.15%、6.60%、21.90%、5.52%、2.12%、4.71%、4.16%、3.31%。

Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Cyanobacteria： 藍(lán)藻門；Actinobacteria：放線菌門；Chlamydiae：衣原體門；Planctomycetes：浮霉菌門；Bcteria_Unclassified：無法歸類的細(xì)菌；Others：其他。

以相對(duì)豐度高于1%為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)門和屬水平下日本沼蝦腸道主要菌群進(jìn)行常規(guī)方差統(tǒng)計(jì)分析(表6)。由表可知，在門水平，主要為變形菌門、厚壁菌門、軟壁菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、放線菌門、衣原體門和浮霉菌門，且僅在YH5組中軟壁菌門相對(duì)豐度顯著高于YH1和YH3組；在屬水平，主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、雷諾氏菌屬(Reyranella)、幾丁質(zhì)桿菌屬(Chitinibacter)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)，其中添加1.0%(YH3組)的酵母水解物可抑制不動(dòng)桿菌屬和希瓦氏菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)；當(dāng)添加4.0%(YH5組)酵母水解物時(shí)，氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和軍團(tuán)菌屬相對(duì)豐度顯著低于YH1組(P<0.05)。

表6 門和屬水平下攝食不同水平酵母水解物后日本沼蝦腸道菌群組成

3 討 論

3.1 酵母水解物對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

在本試驗(yàn)條件下，添加了酵母水解物對(duì)日本沼蝦成活率有所提高，但并未因酵母水解物添加水平不同而與YH1組產(chǎn)生顯著差異。但對(duì)增重率和特定生長(zhǎng)率的分析發(fā)現(xiàn)，添加1.0%酵母水解物時(shí)，日本沼蝦增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于YH1組。這一結(jié)果說明，酵母水解物對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能有一定的促進(jìn)作用。這與在尼羅羅非魚[6]和凡納濱對(duì)蝦[19]中的研究結(jié)果相符。飼喂含1%酵母水解物的飼料可顯著提高尼羅羅非魚[6]和凡納濱對(duì)蝦[19]的增重率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率，并且具有較低的飼料轉(zhuǎn)化率。然而，研究發(fā)現(xiàn)酵母水解物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物提高生長(zhǎng)性能的作用在不同物種、甚至同一物種中也有一定的差異。在異育銀鯽的研究中發(fā)現(xiàn)酵母水解物對(duì)其存活率、蛋白質(zhì)沉積率并沒有顯著影響，只對(duì)特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)有顯著影響[20-21]。在齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)中也發(fā)現(xiàn)酵母水解物僅降低飼料系數(shù)，對(duì)該魚的增重率和特定生長(zhǎng)率沒有顯著影響[22]。曾本和等[23]在加州鱸(Micropterussalmoides)飼料中添加1.3%的酵母水解物可提高該魚的增重率、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率，而Gong等[24]在加州鱸的研究中發(fā)現(xiàn)添加1.5%的酵母水解物才可顯著提高該魚的增重率、特定生長(zhǎng)率。基于酵母水解物對(duì)提高水產(chǎn)動(dòng)物性能的差異性，發(fā)現(xiàn)這極可能與酵母所含成分(如β-葡聚糖、小肽和核苷酸)的含量不同有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，酵母核苷酸具有較好的誘食作用，在飼料中添加0.8%酵母核苷酸能顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦攝食，提高其生長(zhǎng)性能[25]；在飼料中使用β-1，3-葡聚糖飼喂大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)60 d后，泥鰍的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組[26]；在飼料中添加適量小肽也可有效促進(jìn)星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚[27]和石斑魚(Epinepheluscoioides)[29]的生長(zhǎng)。由此可見，酵母水解物提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的差異性不僅與物種、試驗(yàn)條件和試驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)階段有關(guān)，還可能與酵母水解物所含成分含量相關(guān)[30-32]。

3.2 酵母水解物對(duì)日本沼蝦抗氧化指標(biāo)的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，而SOD、GSH-Px等酶可消除機(jī)體內(nèi)氧自由基達(dá)到抗氧化作用[33-34]，因此，MDA含量、SOD、GSH-Px活性以及T-AOC常被用于反映機(jī)體抗氧化能力。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酵母水解物的添加可使蝦體內(nèi)MDA含量顯著下降，同時(shí)T-AOC、SOD、GSH-Px活性等抗氧化指標(biāo)隨著酵母水解物添加水平的增加顯示出先升高后降低的趨勢(shì)。在本試驗(yàn)中，添加4.0%酵母水解物會(huì)顯著降低蝦肝胰腺GSH-Px活性。該結(jié)果說明，添加一定水平的酵母水解物對(duì)日本沼蝦有增強(qiáng)抗氧化能力的作用。這一結(jié)果與在其他水產(chǎn)動(dòng)物中的研究結(jié)果類似。在加州鱸飼料中添加1.5%和3.0%酵母水解物可顯著提高其抗氧化能力[24]；在尼羅羅非魚飼料中添加1%～3%的酵母水解物能顯著提高其血清抗氧化酶活性[6]；在齊口裂腹魚[22]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[35]和草魚(Ctenopharyngodonidellus)[36]中也發(fā)現(xiàn)酵母水解物可提高魚體的抗氧化能力；在異育銀鯽[20-21]中還發(fā)現(xiàn)添加酵母水解物產(chǎn)品可修護(hù)氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的損傷。此外，有研究發(fā)現(xiàn)酵母水解物的抗氧化性能與其所含成分(如酵母β-葡聚糖和小肽物質(zhì))的抗氧化作用密切相關(guān)[37]。飼料中添加0.75%～1.50%小肽可顯著提高星斑川鰈幼魚的抗氧化能力[27]；添加400～800 mg/kg的β-葡聚糖能顯著降低花鱸(Lateolabraxjaponicas)體內(nèi)的MDA含量，起到抗氧化作用[38]；與花鱸研究結(jié)果類似，在凡納濱對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)添加0.02%和0.04% β-葡聚糖時(shí)可顯著提升蝦的抗氧化能力，緩解低鹽應(yīng)激反應(yīng)[39]。因此，在本試驗(yàn)中酵母水解物的添加提高了日本沼蝦的抗氧化性能不排除與產(chǎn)品中的各成分含量有關(guān)。

3.3 酵母水解物對(duì)日本沼蝦免疫性能的影響

研究表明，NO可非特異性的抑制或殺滅細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等對(duì)生物體免疫功能產(chǎn)生影響[40-41]，是機(jī)體內(nèi)激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用的一種有效分子[42]。在沙門氏菌影響大菱鲆免疫結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，NO可消除細(xì)菌病原體[43]。又因NO在體內(nèi)的生物合成由NOS催化，NOS比NO穩(wěn)定性高，通常用NOS活性反映NO含量[40]，故本試驗(yàn)采用NO和NOS作為免疫指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)酵母水解物的添加水平下，NOS活性提高，且在添加水平為4.0%(YH5)時(shí)，肝胰腺NO含量和NOS活性都顯著高于YH1組，說明酵母水解物可提高日本沼蝦的非特異性免疫性能。此結(jié)果與在加州鱸[23]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[43]、大菱鲆[9，44]和尼羅羅非魚[7，45]等水產(chǎn)動(dòng)物中的研究結(jié)果類似，但最佳免疫性能要求的酵母水解物的最適添加水平各有不同。例如，在加州鱸體內(nèi)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)添加1.5%和3.0%的酵母水解物可顯著提高其免疫相關(guān)酶活性，增強(qiáng)免疫反應(yīng)[6]；在體外培養(yǎng)團(tuán)頭魴肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)添加酵母水解物可明顯提高其免疫酶活性和白蛋白含量，同時(shí)免疫相關(guān)基因的表達(dá)通過補(bǔ)充酵母水解物也顯著上調(diào)[43]；在尼羅羅非魚的研究中，Andriamialinirina等[45]發(fā)現(xiàn)添加1%酵母水解物能顯著提高魚體免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，從而提高其免疫性能。這一差異極可能與酵母水解物中β-葡聚糖含量的高低有關(guān)[46-48]。研究表明，酵母水解物中的β-葡聚糖具有改善生長(zhǎng)性能、抗氧化、抗感染、促進(jìn)消化酶分泌等作用，常在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作免疫增強(qiáng)劑使用[49]，所以酵母水解物增強(qiáng)免疫的高低應(yīng)與其含β-葡聚糖含量的高低密切相關(guān)。異育銀鯽攝食酵母β-葡聚糖發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖不僅具有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)和改善肝功能的作用，而且可以增強(qiáng)魚體抵抗嗜水氣單胞菌人工感染的能力[46]。β-1，3/1，6-葡聚糖可刺激湖擬鯉(Rutilusrutiluslacustris)的非特異性抵制機(jī)制，從而改善其吞噬細(xì)胞的胞飲活性，增加其腸道免疫細(xì)胞的數(shù)量[47]。甚至在育種中發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖還可促進(jìn)后代的非特異性免疫[48]。

3.4 酵母水解物對(duì)日本沼蝦腸道菌群的影響

研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)消化吸收、機(jī)體免疫力及抵制疾病等方面有重要作用[50]。本試驗(yàn)使用16S rRNA Illumina高通量測(cè)序數(shù)據(jù)來揭示飼料中酵母水解物對(duì)日本沼蝦腸道菌群的作用，結(jié)果顯示，在門水平中，蝦腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門共8種，在優(yōu)勢(shì)菌群中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，YH5組的軟壁菌門相對(duì)豐度顯著高于YH3和YH1組。這與在尼羅羅非魚、大西洋鮭魚(Salmosalar)等魚類的研究結(jié)果[51-54]類似。有研究指出，變形菌門和軟壁菌門可作為魚體健康指標(biāo)[51]，增加變形菌數(shù)量可以改善大西洋鮭魚的健康狀況[54]；軟壁菌門對(duì)魚體生長(zhǎng)和抑制致病細(xì)菌有積極作用[53-54]。在甲殼動(dòng)物研究上，還未明確指出變形菌門和軟壁菌門的作用，但在對(duì)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門和軟壁菌門是健康蝦腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群[55]。在屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬共11種，其中益生菌為幾丁質(zhì)桿菌屬[56]；有害菌和潛在有害菌為假單胞菌屬[57]、氣單胞菌屬[58]、希瓦氏菌屬[59]、黃桿菌屬[57]、分枝桿菌屬[60]、不動(dòng)桿菌屬[57]和軍團(tuán)菌屬[61]。本試驗(yàn)中雖未檢測(cè)到屬水平上的有益菌相對(duì)豐度因酵母水解物的添加水平增加而增多，但在希瓦氏菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、軍團(tuán)菌屬等致病菌和潛在致病菌中發(fā)現(xiàn)，添加一定量的酵母水解物可有效抑制其生長(zhǎng)。由此可知，使用酵母水解物可抑制日本沼蝦腸道中部分有害菌和潛在有害菌的生長(zhǎng)。這一結(jié)果與在大口鱸魚[62]中的研究結(jié)果類似，但其在優(yōu)勢(shì)菌群種類和促進(jìn)部分有益菌群生長(zhǎng)方面與本研究結(jié)果存在差異。這可能與腸道微生物本身易受環(huán)境、飼料、動(dòng)物自身生長(zhǎng)發(fā)育等因素影響所致[57，63-65]，特別是攝食對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物的影響巨大[64-66]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可反映動(dòng)物的免疫性能[50，67]，并且證明了酵母水解物中所具有的增強(qiáng)免疫性能的物質(zhì)(如甘露寡糖、β-葡聚糖、小肽和核苷酸等)都具有促進(jìn)動(dòng)物體腸道發(fā)育、平衡腸道微生物菌群、加強(qiáng)有益菌的增殖和促進(jìn)腸道自我修復(fù)的功能[67-69]。例如，攝食酵母水解物有助于大口黑鱸腸道中一些益生菌的生長(zhǎng)并抑制有害菌的增殖，從而減少潛在的病原體[62]；而使用酵母β-葡聚糖也可以調(diào)節(jié)塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)的免疫性能，控制其腸道內(nèi)弧菌的增殖[13]；另外，在飼料中添加200～400 mg/kg甘露寡糖就可促進(jìn)泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)腸道發(fā)育，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境[70]。在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)添加4.0%酵母水解物時(shí)，日本沼蝦的免疫性能最強(qiáng)，抑制致病菌的種類最多。因此可推測(cè)，酵母水解物對(duì)腸道菌群的改善作用與這些免疫增強(qiáng)物質(zhì)密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，酵母水解物能顯著提高日本沼蝦的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和免疫性能；酵母水解物對(duì)日本沼蝦腸道菌中希瓦氏菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和軍團(tuán)菌屬等致病菌和潛在致病菌有抑制作用。根據(jù)生長(zhǎng)性能和抗氧化能力，建議日本沼蝦幼蝦飼料中酵母水解物添加水平為1.0%；根據(jù)免疫性能分析，建議日本沼蝦幼蝦飼料中酵母水解物添加水平為4.0%。