王祖艷 曲永利* 張 帥 劉春龍

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 2163319；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心，哈爾濱 2150081)

青貯飼料是奶牛飼糧的主要成分，能夠為其提供大部分營養(yǎng)。全株玉米青貯的制作質(zhì)量直接關(guān)系到反芻動物的健康、生產(chǎn)性能以及養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益[1]。全株玉米具有蛋白質(zhì)和淀粉含量較高以及較好的適口性等優(yōu)良特性，可以單獨發(fā)酵制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料，可被用來替代反芻動物飼糧中精料部分[2]，是我國常用的粗飼料。目前，可以利用青貯添加劑增強發(fā)酵，提高青貯的成功率，解決青貯制作問題，進而解決飼料缺乏時期的飼料供應(yīng)和滿足反芻動物營養(yǎng)需要[3]。許多學者對全株玉米青貯進行了大量研究，為更高效地保證和提高飼料青貯品質(zhì)、縮短發(fā)酵時間并穩(wěn)定青貯飼料的品質(zhì)[4-7]，常常在制作青貯時使用添加劑[8-10]。目前，多種類型的青貯添加劑已經(jīng)實現(xiàn)商品化。而本試驗中使用的添加劑是在生產(chǎn)實踐中被廣泛應(yīng)用的3種添加劑，菌制劑具有生物防治劑和生物防腐劑功能，還具有益生菌的功能，飼喂添加菌制劑處理的青貯對反芻動物瘤胃有一定的影響[11]；有機酸制劑可抑制有害微生物的生長，抑制青貯原料的腐敗變質(zhì)，因此廣泛應(yīng)用于青貯飼料的制作中，其有助于保存青貯飼料中的蛋白質(zhì)和能量，可提高家畜的采食量和產(chǎn)奶量[12]；菌酶復合制劑可以改善青貯品質(zhì)，改善反芻動物瘤胃內(nèi)發(fā)酵過程，提高揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量和瘤胃內(nèi)消化率以及動物生長性能[13]。不同添加劑處理對全株玉米青貯均具有一定的作用，但對動物生產(chǎn)性能的影響結(jié)論尚不統(tǒng)一，并且對奶牛瘤胃菌群的影響研究鮮有報道。因此，本試驗擬研究不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛生長性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及瘤胃微生物功能菌群的影響，旨在為牧場選擇適宜的青貯添加劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料為黑龍江省黑河市某大型規(guī)?；翀龇N植地，品種為先達101，處于蠟熟期的全株玉米，其營養(yǎng)水平見表1。添加劑為菌制劑(山東某生物工程股份有限公司，以乳酸片球菌、植物乳桿菌為主，活菌數(shù)≥2.0×108CFU/g)、有機酸制劑(四川某生物科技股份有限公司，含甲酸、甲酸銨、丙酸、丙酸銨等，有機酸及其鹽含量≥80%)、菌酶復合制劑(山東某生物工程股份有限公司，含乳酸片球菌、植物乳桿菌和纖維素酶等，活菌數(shù)≥2.0×1010CFU/g，酶活力≥20 000 U/g)。全株玉米收割切短，長度2～3 cm，迅速填入青貯窖取不同添加劑溶于水，用噴霧器將青貯復合添加劑均勻地噴灑在青貯表面，其中對照組(CK組)不添加任何添加劑，有機酸組(OA組)按照1.0 g/kg添加有機酸制劑，乳酸菌組(LAB組)按照0.4 g/kg添加乳酸菌制劑，菌酶復合制劑組(LABE組)按照1.0 g/kg添加菌酶復合制劑。隨后進行反復碾壓，壓實后覆上青貯膜和壓窖輪胎完成封窖，青貯發(fā)酵90 d后進行飼用。

表1 全株玉米青貯營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于黑龍江省黑河市某大型規(guī)?；翀鲞M行。選擇2～4胎次、泌乳期(105±5) d、體重、產(chǎn)奶量等相近的健康荷斯坦奶牛80頭，采用完全隨機試驗設(shè)計，分為4組(CK組、OA組、LAB組和LABE組)，每組20頭，分別飼喂無添加劑全株玉米青貯飼糧、添加有機酸制劑全株玉米青貯飼糧、添加菌制劑全株玉米青貯飼糧、添加菌酶復合制劑的全株玉米青貯飼糧，4組均自由采食。試驗期共70 d，其中預(yù)試期10 d，正試期60 d。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能指標測定

干物質(zhì)采食量測定：試驗期內(nèi)每天準確稱量并記錄給料量和剩余料量，計算每頭牛每天的平均采食量。

干物質(zhì)采食量=(實際給料量×干物質(zhì)含量-剩余料量×干物質(zhì)含量)/奶牛頭數(shù)。

產(chǎn)奶量測定：每組隨機選取10頭體重相近的奶牛，正試期每天記錄產(chǎn)奶量。

1.3.2 瘤胃液采集及瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

于正試期第60天晨飼前，每組選取3頭體重相近的健康奶牛，用口腔導管進行瘤胃液采集，抽取前100 mL瘤胃液棄掉，將采集的瘤胃液過濾后分裝到5 mL離心管中并保存于-20 ℃冰箱待測，每頭每天采集200 mL瘤胃液。

瘤胃液pH使用精密型pH測量計測定；氨態(tài)氮(NH3-N)含量參照馮宗慈等[14]改進的方法進行測定；VFA含量待瘤胃液解凍后采用氣相色譜儀進行測定，取5 mL在12 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液至離心管中，加0.15 mL 25%偏磷酸，振蕩搖勻，靜置30 min后在16 000 r/min離心15 min，再用0.45 μm水相濾膜過濾上清液保存待測。其中色譜柱規(guī)格為：300 mm×7.8 mm×5 μm；流動相：2.5 mmol/L硫酸水溶液；流速：0.55 mL/min；柱溫：55 ℃；檢測器：示差檢測器，溫度27 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.3 瘤胃菌群DNA樣品提取、擴增及測序

每組選擇3頭健康的奶牛于試驗期的第1、30和60天晨飼前用口腔導管進行瘤胃液采集，抽取前100 mL瘤胃液棄掉，每頭每天采集20 mL，裝于無菌凍存管中于液氮中保存。樣品采集完成后用提取試劑盒提取總DNA，采用Nanodrop對DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；引物上添加測序接頭和樣本特異性Barcode序列，進而擴增16S rDNA 序列的V3～V4區(qū)，上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本所需的數(shù)據(jù)量進行混樣，測序服務(wù)、數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及統(tǒng)計分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 序列分析

根據(jù)index和Barcode信息，對庫和樣本進行劃分，去除barcode序列。按照Vsearch分析流程進行97%的相似度對序列進行操作分類單元(OTUs)聚類，并對OTUs進行分類學注釋。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2013初步處理后，使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著則采用Duncan氏法進行多重分析，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，OA組、LAB組、LABE組干物質(zhì)采食量均有所提高，但與CK組相比差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛干物質(zhì)采食量的影響

由表3可知，LABE組、OA組產(chǎn)奶量顯著高于CK組(P<0.05)，分別提高了5.4%、4.5%。

表3 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛產(chǎn)奶量的影響

2.2 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，不同添加劑處理的全株玉米青貯對瘤胃內(nèi)pH、NH3-N、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、丁酸含量和乙酸/丙酸無顯著影響(P>0.05)；對乙酸含量有極顯著影響(P<0.01)，LABE組乙酸含量極顯著高于OA組和LAB組(P<0.01)；對丙酸含量有顯著影響(P<0.05)，LABE組丙酸含量顯著高于OA組和LAB組(P<0.05)，與CK組差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果

2.3.1 PCR擴增結(jié)果

提取的瘤胃液用PCR擴增總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并對產(chǎn)物進行擴增。結(jié)果見圖2，可發(fā)現(xiàn)擴增條帶明顯，PCR擴增效果較好，條帶單一明亮，可用于后續(xù)分析。

1～9為CK組瘤胃液樣品，10～18為LABE組瘤胃液樣品，19～27為LAB組瘤胃液樣品，28～36為OA組瘤胃液樣品，M為電泳Marker。

2.3.2 瘤胃液菌群Alpha多樣性分析

由表5可知，4組間Chao1、Observed species、Simpson指數(shù)均差異極顯著(P<0.01)，各組的覆蓋率均高于0.99，說明測序數(shù)據(jù)覆蓋程度較好，足夠體現(xiàn)試驗中每頭奶牛瘤胃菌群情況。由此可以看出，LABE組瘤胃液微生物豐度最高，OA組次之，CK組最低，說明不同添加劑處理的全株玉22米青貯對奶牛瘤胃微生物多樣性具有顯著的影響，添加劑處理的全株玉米青貯可以使奶牛瘤胃微生物多樣性得到改善，有益奶牛瘤胃健康。

表5 奶牛瘤胃微生物多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

2.3.3 微生物菌群物種豐度分析

不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃液菌群門水平上的組成和相對豐度如表6、圖3所示，由圖可知瘤胃液菌群總共含有30個細菌門類，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)為奶牛瘤胃液的優(yōu)勢菌門，各組菌門相對豐度均無顯著差異(P>0.05)，LABE組厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度之和最高，其中3個試驗組奶牛瘤胃液厚壁菌門相對豐度均高于CK組，變形菌門(Proteobacteria)相對豐度均低于CK組。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Tenericutes：柔膜菌門；Actinobacteria：放線菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Cyanobacteria：藍藻門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Fusobcteria：梭桿菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Chloroflexic：綠彎菌門；Lentisphaerae：黏膠球形菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門。

表6 奶牛瘤胃微生物門水平相對豐度

不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃液菌群在屬水平上的組成和相對豐度如表7和圖4所示。瘤胃液菌群總共含有526個細菌屬類，由表7可知，奶牛瘤胃液菌群屬水平主要包括普雷沃菌屬(Prevotella)、產(chǎn)琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、糞球菌屬(Coprococcus)、月形單胞菌屬(Selenomonas)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、毛螺旋菌科下一屬(Shuttleworthia)、梭菌屬(Clostridium)、類普雷沃氏菌科下一屬(YRC22)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)等。由圖4可得，各組間主要優(yōu)勢菌屬為普雷沃菌屬，各組間琥珀酸菌屬、丁酸弧菌屬、糞球菌屬、月形單胞菌屬、假丁酸弧菌屬、毛螺旋菌科下一屬相對豐度均無顯著差異(P>0.05)。3個試驗組梭菌屬相對豐度極顯著低于CK組(P<0.01)，類普雷沃氏菌科下一屬相對豐度極顯著高于CK組(P<0.01)，LAB組和OA組顫螺旋菌屬相對豐度顯著高于CK組(P<0.05)，與LABE組差異不顯著(P>0.05)。

Prevotella：普雷沃菌屬；Succiniclasticum：產(chǎn)琥珀酸菌屬；Butyrivibrio：丁酸弧菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Selenomonas：月形單胞菌；Pseudobutyrivibrio：假丁酸弧菌屬；Shuttleworthia：毛螺旋菌科下一屬；Clostridium：梭菌屬；YRC22：類普雷沃氏菌科下一屬；Oscillospira：顫螺旋菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Sharpea：沙皮菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Treponerna：密螺旋體屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Moryella：莫耶拉菌屬。

表7 奶牛瘤胃微生物屬水平相對豐度

3 討 論

3.1 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛生產(chǎn)性能的影響

干物質(zhì)采食量越多，攝入營養(yǎng)越多，生產(chǎn)性能越高，與飼糧組成、適口性和奶牛自身新陳代謝等因素有關(guān)，其中飼糧組成是影響奶牛干物質(zhì)采食量的主要因素[15-16]。在本試驗中，飼喂奶牛不同添加劑處理的全株玉米青貯，不改變飼糧的組成結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示3個試驗組的干物質(zhì)采食量都高于CK組，但無顯著差異。這與Ellis等[17]在青貯飼料中添加不同菌劑飼喂奶牛對奶牛干物質(zhì)采食量及中性洗滌纖維、脂肪消化率均無顯著差異的結(jié)果相似，這一結(jié)果的產(chǎn)生可能是奶牛對不同添加劑發(fā)酵處理產(chǎn)生不同程度的酸香味不敏感有關(guān)。

產(chǎn)奶量是奶牛生產(chǎn)性能的重要指標之一，其與飼料的營養(yǎng)成分有關(guān)系[18]，Cheli等[19]總結(jié)了1990—1995年期間發(fā)表的有關(guān)青貯添加劑使用效果的文章，其中28%的研究結(jié)果提高了干物質(zhì)采食量，47%的結(jié)果提高奶牛產(chǎn)奶量。傅彤[20]和杲壽善[21]的研究也表明，產(chǎn)奶量顯著提高，這與本試驗結(jié)果一致，說明添加劑對產(chǎn)奶量具有積極作用。還有研究表明，飼糧中蛋白質(zhì)含量也是影響奶牛產(chǎn)奶量的原因之一，本研究試驗組青貯蛋白質(zhì)含量均高于CK組，其中LABE組蛋白質(zhì)含量最高，產(chǎn)奶量也最高，可見蛋白質(zhì)的含量會影響奶牛產(chǎn)奶量。這可能是乳酸改變瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)的吸收利用，使產(chǎn)奶量增加。

3.2 不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

衡量瘤胃發(fā)酵以及微生物代謝平衡的一個重要指標是反芻動物瘤胃液pH[22]，影響瘤胃微生物的活性的原因一部分取決于pH的高低[23]，有研究表明，反芻動物瘤胃液的pH介于6.5～6.8最佳，而本次試驗中，各組奶牛瘤胃液pH都在范圍之內(nèi)，因此能夠保證奶牛正常的瘤胃內(nèi)環(huán)境，這說明不同添加劑處理的全株玉米青貯飼喂奶牛對奶牛瘤胃pH無顯著影響，這與王光華[24]的研究結(jié)果一致。本試驗中各組NH3-N含量均在13～15 mg/mL，處于NH3-N含量的適宜范圍內(nèi)，能為微生物生長以及微生物蛋白合成提供適宜的含量范圍，與Arroauy等[25]和Wickersham等[26]的研究結(jié)果一致，表明其可以滿足奶牛瘤胃微生物的生長所需。TVFA由經(jīng)飼料中的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生，為奶牛日常生長發(fā)育提供所需總能量的70%～80%，主要受飼糧組成及結(jié)構(gòu)、瘤胃微生物和瘤胃pH的影響。TVFA主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，乙酸有利于動物的體脂率和乳脂率提高，丙酸有利于葡萄糖轉(zhuǎn)化和儲存，丁酸可為機體各組織供能。本研究結(jié)果表明，與CK組相比，OA組和LAB組乙酸含量顯著降低，LABE組乙酸含量最高，LABE組丙酸含量顯著高于OA組和LAB組，但各組間乙酸/丙酸和TVFA含量沒有顯著差異，這可能是瘤胃微生物中降解菌的數(shù)量和活性不同導致。其中LABE組乙酸、丙酸以及TVFA含量相對較高，說明菌酶復合制劑處理的全株玉米青貯可以改變瘤胃發(fā)酵類型。

3.3 飼喂不同添加劑處理全株玉米青貯對奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

反芻動物瘤胃中菌群豐富多樣，在種和屬水平上尤為突出，分別包含5 200多個OTUs和3 500多個OTUs[27-28]。其中，在門水平上擬桿菌門和厚壁菌門以及變形菌門是反芻動物瘤胃內(nèi)的主要微生物菌群[29]。在本研究中，3個試驗組中門水平上奶牛瘤胃中厚壁菌門相對豐度最高，其次為擬桿菌門和變形菌門，這一結(jié)果與Zhang等[30]和Cunha等[31]報道一致。在屬水平上，普雷沃菌屬、產(chǎn)琥珀酸菌屬、丁酸弧菌屬、糞球菌屬屬于瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌屬。普雷沃菌屬是反芻動物瘤胃及胃腸道內(nèi)的蛋白質(zhì)降解菌，其促進非纖維多糖和果膠的降解[32]。

在本試驗中，屬水平上普雷沃菌屬、產(chǎn)琥珀酸菌屬相對豐度與CK組相比沒有顯著差異，但均有所升高，豐度最高的分別為LABE組和OA組。本試驗菌群相對豐度的差異主要是梭菌屬、YRC22和顫螺旋菌屬，梭菌若大量繁殖，產(chǎn)生毒素通過改變小腸黏膜的通透性進入血液導致毒血癥，還可導致真胃出血性炎癥、胃腸黏膜充血等，這些都被稱之為梭菌病，當奶牛從環(huán)境中食入大量梭菌時可導致梭菌病的發(fā)生[33-34]。3個試驗組的梭菌屬相對豐度均顯著低于CK組，這可能是不同添加劑處理減少了青貯飼料中梭菌屬相對豐度，從而降低瘤胃中梭菌屬相對豐度。YRC22屬于擬球桿菌目(Bacteroidales)，Paraprevotellaceae科，屬分類名無注釋且目前無相關(guān)研究報道，故無法獲知其實際的生物學功能。

4 結(jié) 論

酸制劑和菌酶復合制劑處理的全株玉米青貯對奶牛生長性能、瘤胃發(fā)酵和瘤胃菌群結(jié)構(gòu)有不同程度的有益作用，其中添加菌酶復合制劑可調(diào)節(jié)奶牛瘤胃中乙酸、丙酸含量，并改變瘤胃發(fā)酵類型。瘤胃微生物中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門始終為優(yōu)勢菌門。不同添加劑處理全株玉米青貯均可提高奶牛瘤胃菌群多樣性，有利于奶牛胃腸道健康，并對瘤胃菌群具有調(diào)節(jié)作用，且菌酶復合制劑添加效果最佳。