陽金金 楊 芷 楊 雨 梁靜茹 肖 霞 楊海明* 王志躍，

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 2225009；2.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，揚州 2225009)

現(xiàn)代肉鵝高度集約化生產(chǎn)模式下，產(chǎn)量快速增長的同時也伴隨著免疫應(yīng)激的增多，如病原微生物、疫苗接種、運輸及環(huán)境污染等諸多因素都會引起免疫應(yīng)激[1]。免疫應(yīng)激嚴重影響肉鵝生長性能并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[2]。因此，采取一定措施緩解免疫應(yīng)激，對提高生產(chǎn)效益和保障肉鵝健康具有重要意義。目前，通過營養(yǎng)調(diào)控來緩解免疫應(yīng)激已成為動物營養(yǎng)學(xué)的重要研究方向[3]。

甜菜堿(betaine，Bet)又稱為三甲基甘氨酸，最早從甜菜副產(chǎn)物中提取而來，廣泛分布于動物、植物和微生物中，具有甲基供體和滲透調(diào)節(jié)功能[4]。Wang等[5]研究顯示，飼糧中添加0.05%甜菜堿提高了肉鴨前期生長性能。Chen等[6]研究表明，飼糧中添加0.05%和0.10%甜菜堿有利于改善肉雞生長性能。楊雨等[7]研究同樣表明，飼糧中添加0.06%～0.18%甜菜堿有利于提高仔鵝前期生長性能。甜菜堿在酒精性或非酒精性脂肪肝、癌癥、糖尿病等疾病中發(fā)揮抗炎作用[8-11]，主要與甜菜堿能抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體活性、調(diào)節(jié)能量代謝以及減輕細胞凋亡有關(guān)[12]。結(jié)合甜菜堿的特性與生產(chǎn)中的研究，人們發(fā)現(xiàn)飼糧中添加甜菜堿有利于畜禽緩解多種應(yīng)激[13-14]。因此，本試驗通過研究飼糧中添加甜菜堿對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激仔鵝生長性能、器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)及脾臟炎性因子表達的影響，以闡明甜菜堿對仔鵝免疫應(yīng)激反應(yīng)和生長性能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜堿為昕洋堿750，有效成分含量為75%，購自北京某科技發(fā)展有限公司。LPS來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)O55∶B5，有效成分含量為97%，購自美國Sigma-Aldrich公司。試驗動物為168只15日齡體重相近且健康的江南白鵝公鵝，其試驗前的飼養(yǎng)管理一致。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗采用2×2雙因子隨機設(shè)計，主因子分別為LPS(腹腔注射LPS或生理鹽水)和甜菜堿(飼糧中不添加或添加0.06%甜菜堿，添加量參照楊雨等[7])。試驗選取168只15日齡的江南白鵝公鵝，隨機分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)7只鵝。試驗設(shè)計見表1。

分別于16、18、20日齡早晨對試驗鵝進行LPS刺激，注射劑量與時間參照Yang等[15]，21、28日齡稱重、屠宰采樣。試驗分為應(yīng)激期(16～21日齡)和恢復(fù)期(22～28日齡)，試驗期13 d。試驗鵝網(wǎng)上平養(yǎng)，飼喂干粉料，自由采食、飲水，自然光照。其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進行。

飼糧配方主要參考揚州大學(xué)家禽生產(chǎn)與營養(yǎng)實驗室歷年的研究成果[16-17]，以玉米、豆粕為基礎(chǔ)原料配制基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長性能

分別于21和28日齡，按重復(fù)對試驗鵝進行稱重(空腹6 h)并記錄，統(tǒng)計各組試驗鵝的采食量和增重情況，并計算應(yīng)激期和恢復(fù)期的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 免疫器官指數(shù)

分別于21和28日齡，從各重復(fù)選取接近平均體重的試驗鵝1只，屠宰后迅速完整剝離并摘取胸腺、脾臟和法氏囊，剔除脂肪和其他黏附組織，稱重并計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官
重(g)/活體重(kg)。

1.3.3 血液指標(biāo)

分別于21和28日齡，翅靜脈采血并分離血清，用UniCel DXC 800 Synchron全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)含量，并計算白蛋白/球蛋白(白球比，A/G)。

1.3.4 脾臟炎癥因子mRNA相對表達量

分別于21和28日齡，從各重復(fù)選取接近平均體重的試驗鵝1只，屠宰后迅速無菌采集脾臟組織，液氮速凍后立即置于-70 ℃冰箱，用于測定脾臟炎癥因子mRNA相對表達量。用總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取脾臟中總RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA稀釋后通過CFX ConnectTM實時熒光定量PCR儀對脾臟炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)mRNA相對表達量進行相對定量分析，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，基因引物信息見表3。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green PCR Master Mix (2×) 10 μL，上、下游引物各1.4 μL，cDNA模板1 μL、無酶水6.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s，共39個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表3 基因引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2017進行初步整理，利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件的一般線性模型(GLM)程序進行雙因素方差分析，模型主效應(yīng)包括LPS、甜菜堿及兩者的互作效應(yīng)。當(dāng)有互作效應(yīng)時，采用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。P≤0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

如表4所示，在應(yīng)激期，LPS刺激顯著降低仔鵝21日齡體重、ADFI和ADG(P≤0.05)，顯著提高F/G(P≤0.05)，而添加甜菜堿具有提高仔鵝21日齡體重(P=0.090)和ADFI(P=0.080)的趨勢，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝21日齡體重有互作效應(yīng)趨勢(P=0.075)，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝ADFI有顯著互作效應(yīng)(P≤0.05)。這表明飼糧中添加甜菜堿可以緩解由LPS刺激引起ADFI的降低。

表4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

在恢復(fù)期，LPS刺激顯著降低仔鵝28日齡體重、ADFI和F/G(P≤0.05)，對ADG無顯著影響(P>0.05)；添加甜菜堿對仔鵝恢復(fù)期生長性能無顯著影響(P>0.05)。

2.2 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數(shù)的影響

如表5所示，21日齡時，LPS刺激顯著降低仔鵝胸腺指數(shù)(P≤0.05)，而添加甜菜堿顯著提高了仔鵝胸腺指數(shù)(P≤0.05)。LPS刺激和添加甜菜堿對各器官指數(shù)均無顯著互作效應(yīng)(P>0.05)。

表5 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數(shù)的影響

2.3 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標(biāo)的影響

如表6所示，21日齡時，LPS刺激顯著降低仔鵝血清白蛋白含量和白球比(P≤0.05)，顯著提高血清球蛋白含量(P≤0.05)；LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝血清白蛋白含量有顯著互作效應(yīng)(P≤0.05)。這表明飼糧中添加甜菜堿能夠一定程度上阻止LPS刺激對仔鵝血清中白蛋白含量的降低作用。

表6 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標(biāo)的影響

續(xù)表6項目Items21日齡 21 days of age總蛋白TP/(g/L)白蛋白ALB/(g/L)球蛋白GLO/(g/L)白球比 A/G28日齡 28 days of age總蛋白TP/(g/L)白蛋白ALB/(g/L)球蛋白GLO/(g/L)白球比 A/GP值 P-value脂多糖 LPS0.4110.0120.045<0.0010.0660.8530.0550.105甜菜堿 Bet0.4080.1230.6180.3980.7140.7090.5720.637互作效應(yīng) Interaction0.2830.0190.6320.0620.1530.8990.1330.301

2.4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝脾臟炎性因子mRNA相對表達量的影響

如圖1所示，21日齡時，LPS刺激顯著提高仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量(P≤0.05)，而添加甜菜堿顯著降低脾臟IL-1βmRNA相對表達量(P≤0.05)。28日齡時，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝脾臟炎癥因子mRNA相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。

圖1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝脾臟炎性因子mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

LPS是革蘭氏陰性細菌的主要致病性因子，由脂質(zhì)A、核心多糖及O抗原3部分組成[18]。腹腔或肌肉注射LPS是目前構(gòu)建動物免疫應(yīng)激模型最常用的方式。免疫應(yīng)激使機體產(chǎn)生全身炎性反應(yīng)，引發(fā)食欲減退、采食量下降、嗜睡等生理和行為的變化[19]，進而導(dǎo)致生長性能下降。Liu等[20]在肉仔雞12、14、33和35日齡分別腹腔注射0.5 mg/kg BW的LPS，發(fā)現(xiàn)LPS刺激對肉仔雞1～21日齡、22～42日齡及1～42日齡ADG和ADFI均有不良影響。本試驗中，LPS刺激顯著降低了仔鵝21日齡體重和16～21日齡ADFI、ADG，提高了16～21日齡F/G，這與前人在肉雞方面的研究結(jié)果[21-22]類似，同時提示本次免疫應(yīng)激模型構(gòu)建成功。甜菜堿作為有效飼料添加劑，具有促生長、改善胴體組成及提高肉品質(zhì)的作用[23]。Liu等[24]試驗表明，飼糧中添加0.05%、0.10%、0.20%甜菜堿可以減輕熱應(yīng)激對黃羽肉雞采食量和體重的不利影響，且存在劑量效應(yīng)。Hamidi等[25]報道，飼糧中添加0.12%甜菜堿能顯著提高混合球蟲感染肉雞的ADG，可能與甜菜堿對腸道上皮細胞和腸道黏膜的保護作用有關(guān)。Wang等[26]研究表明，飼糧中添加甜菜堿通過增強腸組織功能、降低腹瀉率、促進營養(yǎng)物質(zhì)消化來改善斷奶仔豬的生長性能。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激期，飼糧中添加甜菜堿具有提高21日齡體重和ADFI的趨勢，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝21日齡體重有互作效應(yīng)趨勢，對ADFI有顯著互作效應(yīng)，表明甜菜堿能緩解LPS刺激對仔鵝生長性能的影響，其原因可能與甜菜堿具有誘食性進而提高了采食量有關(guān)。

3.2 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽的主要免疫器官，這3個器官的指數(shù)是評價家禽免疫狀況的重要指標(biāo)[27]。胸腺是細胞免疫的重要器官，脾臟是產(chǎn)生抗體、補體等免疫物質(zhì)的最大免疫器官，法氏囊是家禽特有的體液免疫器官。本試驗中，LPS刺激導(dǎo)致21日齡仔鵝胸腺指數(shù)顯著下降，這與孫驍?shù)萚28]報道仔豬LPS刺激的結(jié)果一致。研究表明，胸腺萎縮與胸腺細胞凋亡有關(guān)，胸腺組織和胸腺組織中的淋巴細胞同時隨著年齡增長而減少[29]。而飼糧中添加甜菜堿緩解了LPS刺激對仔鵝胸腺的不利影響，表明甜菜堿可以增強仔鵝的免疫功能，可能與甜菜堿提供甲基、促進蛋白質(zhì)合成，進而促進細胞生長有關(guān)[30]。安立龍等[31]報道，飼糧中添加0.1%甜菜堿可以減弱熱應(yīng)激對肉雞胸腺、脾臟組織的損傷作用，保護組織結(jié)構(gòu)的完整性。酒精性肝損傷模型試驗中，甜菜堿主要通過降低炎性因子表達、減少脂質(zhì)過氧化及預(yù)防細胞凋亡來發(fā)揮護肝功能[32-33]。

3.3 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標(biāo)的影響

血清中某些成分變化在一定程度上可以反映動物機體的生理狀態(tài)。血清總蛋白來自肝臟合成和腸道吸收，主要包括白蛋白和球蛋白。白蛋白是血清總蛋白的主要蛋白質(zhì)成分，可維持血漿膠體滲透壓，在體內(nèi)代謝物質(zhì)的運輸、營養(yǎng)和組織修復(fù)等方面都起著重要的作用[34]，球蛋白由機體免疫器官產(chǎn)生，反映機體免疫力，當(dāng)機體受到病原體攻擊時，免疫系統(tǒng)就會增加球蛋白的產(chǎn)生。本試驗中，LPS刺激導(dǎo)致21日齡仔鵝血清白蛋白含量顯著降低，球蛋白含量顯著升高，白球比顯著降低，表明機體受到應(yīng)激，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。而LPS刺激與添加甜菜堿對血清白蛋白含量存在顯著互作效應(yīng)，說明飼糧中添加甜菜堿能夠一定程度上阻止LPS刺激對血清白蛋白含量的降低作用，添加甜菜堿有利于白蛋白合成，提高對組織損傷的修復(fù)作用。Remus等[35]提出飼糧中添加甜菜堿對血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量具有改善作用，主要與甜菜堿能提供甲基、促進蛋白質(zhì)合成有關(guān)。Yang[36]等研究同樣表明，飼糧中添加0.06%甜菜堿可以提高仔鵝血清總蛋白含量。然而Ghasemi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1%甜菜堿對飼喂不同蛋白質(zhì)水平的熱應(yīng)激肉雞血清總蛋白含量沒有顯著影響，但可以提高抗新城疫和傳染性支氣管炎病毒的抗體滴度。

3.4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝炎性細胞因子表達的影響

天然免疫是機體抵抗病原微生物侵襲的第1道防線，研究表明，LPS是活化機體免疫系統(tǒng)中巨噬細胞(先天免疫細胞)的有效誘導(dǎo)物，促使炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的合成與分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)[38]。Li等[39]通過體外試驗證明，LPS攻毒小鼠巨噬細胞后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和趨化因子等mRNA相對表達量顯著上升。本試驗中，LPS刺激顯著提高21日齡仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量，對IL-6 mRNA相對表達量有增加趨勢。Li等[40]和Shen等[41]在LPS刺激肉雞試驗中也觀察到類似結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加甜菜堿顯著降低21日齡仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量。IL-1β在機體應(yīng)對感染和炎癥損傷中具有重要作用，IL-1β是NF-κB下游基因之一。Xia等[42]指出，甜菜堿可抑制NF-κB的活化從而降低IL-1β的表達。Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿降低炎性因子IL-6 mRNA相對表達量與抑制其啟動子區(qū)域的甲基化有關(guān)。TGF-β是重要的抗炎因子，具有促進細胞生長、分化和免疫調(diào)節(jié)作用，LPS刺激和添加甜菜堿對TGF-βmRNA相對表達量都沒有顯著影響。

4 結(jié) 論

LPS刺激降低仔鵝生長性能和免疫性能，而飼糧中添加0.06%甜菜堿可以改善仔鵝生長性能，提高胸腺指數(shù)，降低脾臟促炎因子IL-1βmRNA相對表達量，從而在一定程度上緩解LPS刺激對仔鵝的負面影響。甜菜堿對LPS刺激應(yīng)激期的緩解作用比恢復(fù)期更為明顯。