李 凈 倪姮佳* 黃勇剛 李 夢 譚碧娥

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)基因組與種質創(chuàng)新研究中心，長沙 2410128；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 2410125)

新生仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠成熟，斷奶前主要依賴于豬乳中母源抗體的保護[1]。斷奶后，由于飼喂環(huán)境及飲食的改變，細菌、病毒、真菌等病原微生物通過損傷免疫器官和細胞，干擾抗原呈遞，抑制或阻斷抗體的生成，導致仔豬抗病能力下降，引發(fā)免疫抑制[2-5]。免疫抑制仔豬的臨床癥狀為淋巴細胞(LYM)數(shù)量減少、活性下降，抗體生成減少，免疫器官發(fā)育不良等，表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、腹瀉嚴重及死亡率高[6-9]。因此，研究免疫抑制仔豬的營養(yǎng)調控對提高斷奶仔豬存活率、提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。

鈣和磷是生物必需的元素，參與構建骨骼、肌肉、神經和體液等組織，參與神經傳遞、肌肉收縮以及激素分泌等重要生理過程[10]。鈣離子作為第二信使參與了B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞等免疫細胞間的信號傳遞[11]。磷也是代謝和信號傳導過程的重要元素，與鈣元素一起參與骨骼代謝和免疫調節(jié)[12]。當仔豬處于非健康狀態(tài)時，機體對礦物元素的需要量與健康狀態(tài)時存在差異，因此，部分學者認為適當提高非健康仔豬的礦物元素供給有助于改善免疫系統(tǒng)功能，縮短病程[13-14]。另外，研究表明，補鈣可顯著緩解高脂飲食導致的結腸炎癥和免疫反應[15]；提高細胞內鈣離子的濃度可顯著調高細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的功能[16]。因此，依據(jù)前人研究結果推測，適當補鈣有助于提高機體的免疫功能，緩解免疫抑制對仔豬生長發(fā)育造成的影響，但目前缺乏相關的研究。

伊立替康(irinotecan，CPT)是一種治療癌癥的化療藥物，具有抑制機體免疫功能的副作用，臨床表現(xiàn)為嚴重腹瀉[17-18]，目前，該藥物常用于建立動物免疫抑制模型。研究表明，斷奶仔豬在1.5倍NRC標準的鈣水平飼糧飼喂下，料重比(F/G)最低，平均日增重(ADG)最高，生長性能達到最優(yōu)[19]。在對仔豬沒有毒副作用的前提下，本研究想進一步探討1.5倍NRC(2012)標準的鈣、磷對免疫的調控機制，擬通過腹腔注射CPT(注射劑量18 mg/kg BW)建立免疫抑制仔豬模型[20]，研究適當提高飼糧鈣、磷水平(固定鈣∶磷為1.2∶對CPT所致免疫抑制仔豬生長性能、血液生理生化指標及礦物元素代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、分組和飼養(yǎng)管理

本試驗選取18頭2～4胎次22日齡的“杜長大”三元雜交斷奶仔豬，公母各占1/2，隨機分為3組，分別為對照組、模型組和試驗組，其中對照組和模型組的飼糧鈣、磷水平參考NRC(2012)標準，試驗組的飼糧鈣、磷水平為1.5倍NRC(2012)標準。每個組6個重復，每個重復1頭豬，所有豬只單欄飼養(yǎng)。試驗選用2種基礎飼糧(飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1)，分別用于試驗Ⅰ期(第1～14天)和試驗Ⅱ期(第15～28天)。試驗第23天，模型組和試驗組仔豬腹腔注射18 mg/kg BW CPT，連續(xù)注射4 d，對照組注射等量生理鹽水。試驗期間所有豬只自由采食和飲水(以吃完后料槽內有少量剩料為準)，每天飼喂3次(08：00、12：00和18：00)。飼喂期間觀察仔豬健康和腹瀉情況，記錄每日飼糧消耗量。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目 Items22～35日齡 22 to 35 days of ageNRC (2012)1.5×NRC (2012)36～49日齡 36 to 49 days of ageNRC (2012)1.5×NRC (2012)L-色氨酸 L-Trp0.060.060.050.05預混料 Premix2)0.500.500.500.50合計 Total100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)消化能 DE/(MJ/kg)14.4113.7014.4213.78代謝能 ME/(MJ/kg)14.2513.5514.3213.67粗蛋白質 CP 17.9417.8917.6417.46粗脂肪 EE3.103.524.194.70鈣 Ca0.811.190.721.07總磷 TP0.691.000.570.84有效磷 AP0.490.800.360.64

1.2 樣本采集

試驗第29天，對禁食12 h的仔豬進行屠宰采樣。采集前腔靜脈血液，一部分置于5 mL乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，用于測定血常規(guī)和血漿生化指標；另一部分置于普通采血管中，靜置15 min后，1 237×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存，用于血清微量元素含量的測定。仔豬放血處死后取出肝臟、腎臟和結腸食糜，并于-20 ℃保存，用于鈣、磷、銅、鐵和錳含量的測定。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能和腹瀉指數(shù)

記錄仔豬每天的采食量，于試驗第1、15和29天早上對仔豬進行空腹稱重，計算試驗Ⅰ期、試驗Ⅱ期和全期的ADG、平均日采食量(ADFI)和F/G。

試驗期間觀察并記錄每頭仔豬每天的腹瀉情況，依據(jù)腹瀉狀況評分標準進行評分[21]，不腹瀉為0分，輕度腹瀉為1分，中度腹瀉為2分，重度腹瀉為3分，分別計算試驗Ⅰ期、試驗Ⅱ期和全期的腹瀉指數(shù)，計算公式如下：

腹瀉指數(shù)=每頭仔豬腹瀉評分之和/
該頭仔豬飼養(yǎng)天數(shù)。

1.3.2 血常規(guī)指標

使用全自動血液細胞分析儀(BC-5000VET，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定血液中各類常規(guī)指標，包括白細胞(WBC)、中性粒細胞(NEU)、LYM、單核細胞(MON)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BAS)及紅細胞(RBC)數(shù)量、血紅蛋白(HGB)含量、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)、血小板(PLT)數(shù)量、平均血小板體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)以及血小板壓積(PCT)等。

1.3.3 血漿生化指標

使用全自動生化分析儀(Cobas c311，羅氏公司)測定仔豬血漿中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、補體4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)的含量以及谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的活性等。測定方法參照相關試劑盒說明書。

1.3.4 肝臟、腎臟、結腸上段食糜和血清中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量

取15.0 g左右肝臟、腎臟和結腸上段食糜冷凍干燥并粉碎。稱取0.20 g粉碎樣品或0.5 mL血清置于微波消解罐中，依次加入10 mL濃硝酸和1 mL過氧化氫，使用微波消解儀進行消煮，消煮結束后在消解罐中再加入0.5 mL高氯酸，180 ℃趕酸2 h。最后，用1%硝酸定容至10 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Agilent 5110 ICP-OES)檢測樣品中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

仔豬免疫抑制模型評估采用SPSS 25.0軟件進行t檢驗(student’st-test)，其余試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較。試驗結果以平均值(mean)和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 仔豬免疫抑制模型的建立

以腹瀉指數(shù)和血液免疫細胞數(shù)為指標，對本研究建立的免疫抑制仔豬模型進行評估，結果如圖1所示，建模后(試驗第23～28天)，與對照組相比，模型組仔豬血液中WBC、NEU、LYM、MON和EOS的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)，表明本試驗的免疫抑制仔豬模型建立成功。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.2 鈣、磷對免疫抑制仔豬生長性能和腹瀉指數(shù)的影響

鈣、磷對免疫抑制仔豬生長性能和腹瀉指數(shù)的影響結果如表2所示。試驗Ⅰ期，各組間仔豬生長性能和腹瀉指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。試驗Ⅱ期，與對照組相比，模型組仔豬ADG顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)/G和腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)；而與模型組相比，試驗組仔豬ADG有升高趨勢(P>0.05)，F(xiàn)/G有降低趨勢(P>0.05)，腹瀉指數(shù)顯著降低(P<0.05)。試驗全期，對照組仔豬ADG顯著高于其他2組(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著低于其他2組(P<0.05)。

表2 鈣、磷對免疫抑制仔豬生長性能和腹瀉指數(shù)的影響

2.3 鈣、磷對免疫抑制仔豬血常規(guī)指標的影響

鈣、磷對免疫抑制仔豬血常規(guī)指標的影響結果如表3所示。與對照組相比，模型組和試驗組仔豬血液中WBC、NEU、LYM和EOS的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，模型組仔豬血液中MON的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，血液中HGB的含量顯著升高(P<0.05)；而與模型組相比，試驗組仔豬血液中MON的數(shù)量有升高趨勢(P>0.05)，血液中HGB的含量有降低趨勢(P>0.05)。

表3 鈣、磷對免疫抑制仔豬血常規(guī)指標的影響

續(xù)表3項目 Items對照組Control group模型組Model group試驗組Experimental groupSEMP值P-value血小板 PLT/(×109個/L)310.20278.17262.5029.6980.829平均血小板體積 MPV/fL9.789.7710.220.1570.430血小板體積分布寬度 PDW/%15.2615.1815.250.0900.939血小板壓積 PCT/%0.300.270.260.0270.875

2.4 鈣、磷對免疫抑制仔豬血漿生化指標的影響

鈣、磷對免疫抑制仔豬血漿生化指標的影響結果如表4所示。與對照組相比，模型組和試驗組仔豬血漿中TP的含量顯著升高(P<0.05)，模型組和試驗組仔豬血漿中TP的含量無顯著差異(P>0.05)。

表4 鈣、磷對免疫抑制仔豬血漿生化指標的影響

2.5 鈣、磷對免疫抑制仔豬肝臟、腎臟、血清和結腸食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

飼糧添加高鈣、高磷對免疫抑制仔豬肝臟、腎臟、血清和結腸食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響結果如表5～表8所示。與對照組相比，模型組和試驗組仔豬血清中銅的含量顯著升高(P<0.05)(表5)，結腸上段食糜中銅、鐵的含量顯著降低(P<0.05)(表6)。與對照組和模型組相比，試驗組仔豬肝臟中磷的含量顯著升高(P<0.05)(表7)。飼糧添加高鈣、高磷對免疫抑制仔豬腎臟中鈣、磷、銅、鐵和錳的含量無顯著影響(P>0.05)(表8)。

表5 鈣、磷對免疫抑制仔豬血清中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表6 鈣、磷對免疫抑制仔豬結腸上段食糜中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表7 鈣、磷對免疫抑制仔豬肝臟中鈣、磷、銅、鐵和錳含量的影響

表8 鈣、磷對免疫抑制仔豬腎臟中鈣、磷、銅、鐵、錳含量的影響

3 討 論

當機體發(fā)生免疫抑制時，動物生長發(fā)育緩慢。研究發(fā)現(xiàn)，母豬采食脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染的飼糧，會產生免疫抑制，并且使得ADFI顯著降低，生長速度減慢[7]；給BALB/C小鼠腹腔注射100 mg/kg CPT會引發(fā)小鼠延遲性腹瀉[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，CPT嚴重影響了斷奶仔豬的生長，并導致了腹瀉，而提高飼糧的鈣、磷水平可顯著降低免疫抑制仔豬的腹瀉指數(shù)，有助于提高仔豬的ADG，這一現(xiàn)象可能與膳食鈣對腸道健康的調控有關。Zhang等[23]比較不同水平丙酸鈣對犢牛生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)補鈣可以改善犢牛的ADG和飼料轉換率。此外，研究表明，高鈣飼糧可以通過緩解腸腔內的有害物質對腸黏的刺激，抑制腸道通透性的增加，最終緩解腹瀉[24]。

血液中WBC的數(shù)量與體內的免疫反應有關。其中，NEU比例升高可能為細菌感染[25]，LYM比例發(fā)生變化可能與病毒感染有關[26]。研究表明，鈣離子可調控LYM的功能，并作為第二信使參與了免疫細胞間的信號傳導[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高飼糧鈣、磷水平有助于提高免疫抑制仔豬血液中MON的數(shù)量，該現(xiàn)象可能與鈣對MON功能的調控有關。因為鈣可通過作用于MON的鈣敏感受體，促進MON的聚集，從而調節(jié)體內和體外的先天免疫應答[29]。當機體免疫功能受阻時，血液生化指標也會產生變化[30]。例如嘔吐、腹瀉、高熱和休克等可導致血漿因水分喪失而濃縮，使得血漿蛋白含量相對性升高[31]。本研究中，免疫抑制仔豬的血漿TP含量升高可能與免疫抑制仔豬的嚴重腹瀉有關。

雖然補充礦物元素對機體健康有諸多好處，但其對免疫功能的調控具有兩面性。缺乏或過量均會導致免疫抑制，并且補充過高劑量的鈣、磷還會影響其他微量元素的吸收和代謝[32]。因此，為了探討本試驗所使用的鈣、磷水平是否影響了微量元素的代謝，我們對仔豬臟器和結腸食糜中的礦物元素含量進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，免疫抑制仔豬飼喂1.5倍NRC(2012)水平的鈣、磷后，肝臟中的微量元素含量與對照組無顯著差異，而肝臟是機體儲存微量元素的主要器官，這表明本試驗所用的鈣、磷劑量對機體的微量元素代謝無顯著影響。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制仔豬結腸食糜中銅的含量顯著降低，血清中銅的含量顯著升高，表明免疫抑制仔豬會提高對銅的利用率。銅是參與免疫反應的關鍵元素，病畜適當補充銅元素有助于提高機體的免疫功能，恢復正常的生理功能[33]。因此，本研究中仔豬的銅利用率升高可能是機體在免疫抑制狀態(tài)下的一種反饋調節(jié)，促進了仔豬免疫功能的恢復。

4 結 論

① 仔豬腹腔注射CPT可引起仔豬腹瀉，嚴重影響仔豬的生長性能，降低仔豬血液中免疫細胞的數(shù)量，據(jù)此建立仔豬免疫抑制模型。

② 飼糧補充1.5倍NRC(2012)標準的鈣、磷可有效緩解CPT所致免疫抑制對仔豬生長的影響，減少腹瀉，有助于恢復血液中MON的數(shù)量，并且不會干擾其他微量元素的代謝。