張譯心王鑫劉博紀(jì)鳳蘭溫富春丁濤徐惠波?

(1. 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,長春 130012; 2. 長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以糖脂代謝紊亂為特征的慢性代謝病,屬于中醫(yī)“消渴”范疇,臨床上可將2 型糖尿病分為氣陰兩虛證、陰陽兩虛證、血瘀氣滯證和陰虛熱盛證4 個(gè)證型[1-2]。為了在基礎(chǔ)研究中實(shí)現(xiàn)對糖尿病的不同證型進(jìn)行對證治療,以更好地了解并詮釋中藥治療的機(jī)制,采用“擬臨床研究”的原則制備病證結(jié)合動(dòng)物模型不失為一種較好的研究方法之一。病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立,一方面可為臨床治療提供可靠有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù),從而進(jìn)一步了解臨床疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律;另一方面,它既能反映中醫(yī)證候特點(diǎn),又能體現(xiàn)疾病的病理變化,與單一疾病模型比較,在研究中藥作用時(shí)能更充分地突顯傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對疾病治療的優(yōu)勢[3-4]。本文通過高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素(steptozocin,STZ)制備2 型糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型,通過采集大鼠體征變化和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),對氣陰兩虛證大鼠模型進(jìn)行評價(jià),為2 型糖尿病氣陰兩虛證模型的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48 只健康 6 周齡雄性 SPF 級 SD 大鼠,體重(160 ± 10)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司【SCXK(遼)-2020-0001】,飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)研究院屏蔽環(huán)境動(dòng)物室【SYXK(吉)2020-0009】,室溫18 ～25℃,相對濕度50% ～60%,每天12 h光照,12 h 黑暗循環(huán),大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(倫理審批號:JLSZKYDWLL2019-001)。

1.1.2 飼料

高糖高脂KK 飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司,維持飼料購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(Sigma 公司,WXBC7268 V),檸檬酸(北京化工廠,20150925),檸檬酸鈉(北京化工廠,20180103),肝素鈉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,151809086A),甲醛(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司,20170305)葡萄糖試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司,193691),cAMP、cGMP 試劑盒(美國 RD 公司,201912),CD4、CD8 試劑盒(美國RD 公司,202006)。

BGM506 型血糖儀(深圳市家康科技有限公司,中國),HS11 型數(shù)碼相機(jī)(富士公司,日本),PowerLab/8S 型多導(dǎo)生物記錄儀(AD Instruments,日本),ELx800 型酶標(biāo)儀(BioTek Instruments Inc,美國),GF-D800 型半自動(dòng)生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司,中國),CS-600B 型全自動(dòng)生化分析儀(長春迪瑞實(shí)業(yè)有限公司,中國),YLS-13 A型大鼠抓力測定儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司,中國),DT5-3 型低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司,中國),Leica RM2255 型石蠟切片機(jī)(Leica,德國),Leica EG1140 型石蠟包埋機(jī)(Leica,德國),OlympusBX51型光學(xué)顯微鏡(Olympus,日本),NIS-ELEMNT BR 型圖像分析系統(tǒng)(NIKON,日本)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模

SD 大鼠 48 只隨機(jī)分為空白組(A 組 12 只)、病證模型組(B 組20 只)和高糖高脂組(C 組16 只),A 組喂飼普通飼料,其余兩組喂飼高脂飼料。飼養(yǎng)4 周后,B 組大鼠禁食12 h 以40 mg/kg 劑量腹腔注射STZ(在4℃冰浴中,以0.1 mol/L 濃度 pH=4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制),A 組和C 組腹腔注射同體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射1 周后測定B 組大鼠空腹血糖,空腹血糖值大于11.1 mmol/L 即視為糖尿病造模成功,繼續(xù)飼養(yǎng)至14 周試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 模型評估標(biāo)準(zhǔn)

《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中2 型糖尿病氣陰兩虛證候表現(xiàn)如下:咽干口燥、倦怠乏力、多食易饑、口渴喜飲、氣短懶言、舌紅少津液、脈細(xì)數(shù)無力[5]。以氣陰兩虛證候的臨床表現(xiàn)為依據(jù),設(shè)計(jì)“大鼠體征采集表”,采集相關(guān)指標(biāo)作為模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(見表1,2)。

1.2.3 大鼠一般狀態(tài)

每周觀察大鼠體征變化,對照評分表記錄每只大鼠的運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)的分值,分值越高,運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)越差,表明大鼠體征越符合氣陰兩虛證候表現(xiàn)。

1.2.4 體重、進(jìn)食量、飲水量測定

每周稱量大鼠體重,記錄大鼠24 h 進(jìn)食量和飲水量1 次,進(jìn)食量=(每籠飼料添加量-24 h 后飼料剩余量)/每籠動(dòng)物只數(shù),飲水量=(每籠飲水添加量-24 h 后飲水剩余量)/每籠動(dòng)物只數(shù)。

1.2.5 抓力測定

每4 周測定1 次:先用右手將大鼠按放在抓力板上,左手向前推抓力板,然后右手滑至鼠尾部,左手松開抓力板,待大鼠用力抓住抓力板時(shí),及時(shí)加力后拉,以得到最大抓力,各組每只大鼠連續(xù)測量3次,取平均值。

1.2.6 呼吸、脈搏測定

于實(shí)驗(yàn)第14 周測定大鼠呼吸、脈搏:大鼠麻醉狀態(tài)下背部朝上放在置于桌面上(自然俯臥狀態(tài)),將呼吸傳感器的壓力帶自然平鋪在于大鼠背腹部上;將脈搏傳感器對準(zhǔn)大鼠尾根處的靜脈血管,纏繞壓力帶時(shí)注意力度適中,連接多導(dǎo)生理記錄儀,使用Lab Chart7 軟件記錄各組大鼠的呼吸頻率及脈搏幅度。

表1 大鼠體征采集表Table 1 Evaluation criteria for collecting rat signs

表2 運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)評分表Table 2 A rating scale for state of motion and state of mind

1.2.7 舌象分析

于實(shí)驗(yàn)第14 周采集大鼠舌象信息:大鼠麻醉狀態(tài)下,輕背位固定,皮筋牽拉大鼠口腔,使舌體自動(dòng)暴露,數(shù)碼相機(jī)關(guān)閉閃光燈,近景拍攝模式下,將大鼠舌面與標(biāo)準(zhǔn)色卡對照拍攝。分析采用Photoshop 7.0 軟件,設(shè)定色階:黑色:L:22,a:0,b:0;灰色:L:58,a:0,b:0;白色:L:93,a:0,b:0。使用套圈工具,選定舌面(從舌尖到舌面中部),利用Photoshop 7.0軟件中“直方圖”工具,計(jì)算該區(qū)域的紅色值(R值)、綠色值(G 值)、藍(lán)色值(B 值)。R、G、B 值均為0 時(shí)為純黑色,均為255 時(shí)為純白色,提示舌象R、G、B 值減小,表明舌體顏色越暗,越接近純黑色,血瘀證時(shí)舌體顏色呈暗紫色[6]。

1.2.8 血糖測定

從第4 周開始,每隔1 周測定1 次大鼠的隨機(jī)血糖、空腹血糖(禁食12 h),尾靜脈采血,采用血糖儀測定血糖值。

1.2.9 尿糖檢測

于實(shí)驗(yàn)第 8、12、14 周,每組隨機(jī)選取 10 只大鼠,收集尿液,進(jìn)行尿糖檢測。

1.2.10 糖耐量測定

實(shí)驗(yàn)第14 周最后1 d,每組隨機(jī)選取8 只大鼠禁食12 h,灌胃葡萄糖溶液(2 g/kg),尾靜脈取血,測定大鼠服糖后0、30、60、120 min 的血糖值,繪制糖耐量曲線。采用近似梯形法計(jì)算口服糖耐量試驗(yàn)過程中血糖曲線下面積(area under curve,AUC)。

1.2.11 凝血功能檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,大鼠腹腔麻醉,每組隨機(jī)選取8 只大鼠,腹主動(dòng)脈取血0.5 mL,3.8%檸檬酸鈉抗凝,全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)檢測。

1.2.12 血清 TC、TG、LDL-C 指標(biāo)檢測

每組隨機(jī)選取8 只大鼠,腹主動(dòng)脈取血,全自動(dòng)生化分析儀分析膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)。

1.2.13 血清 cAMP、cGMP 含量測定及 cAMP/cGMP 計(jì)算

每組隨機(jī)選取8 只大鼠,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆?。用酶?lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥甘酸(cGMP)的含量,并計(jì)算cAMP/cGMP 值。

1.2.14 血清CD4、CD8 含量測定及CD4/CD8 計(jì)算

每組隨機(jī)選取8 只大鼠,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,-80℃保存?zhèn)溆?。用酶?lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)鳥甘酸(cGMP)的含量,并計(jì)算cAMP/cGMP 值。

1.2.15 胸腺指數(shù)測定

每組隨機(jī)選取8 只大鼠,稱量大鼠麻醉前體重,腹主動(dòng)脈取血,稱取胸腺重量,計(jì)算胸腺指數(shù),胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重×100%。

1.2.16 胰腺組織HE 染色觀察

每組隨機(jī)選取8 只大鼠,摘取胰腺,將其固定于10%福爾馬林溶液中,HE 染色,做光鏡下胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 One-way ANOVA 最小顯著性差異法(LSD)作兩兩比較,以P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的觀察

結(jié)果顯示,第0 ～14 周時(shí)A 組大鼠精神狀態(tài)良好、活躍好動(dòng)、反應(yīng)靈敏迅速;與A 組比較,第8 ～14 周 B 組大鼠精神、運(yùn)動(dòng)評分均顯著升高(P<0.01),從第8 周開始精神、運(yùn)動(dòng)評分均逐漸升高,說明B 組大鼠精神狀態(tài)逐漸由正常轉(zhuǎn)為呆滯,行動(dòng)逐漸變得遲緩,14 周時(shí)大鼠對外界刺激無反應(yīng)或反應(yīng)遲鈍;C 組大鼠精神、運(yùn)動(dòng)評分與A 組比較始終無顯著性差異,表明大鼠精神狀態(tài)良好,行動(dòng)活躍(圖1)。

2.2 大鼠不同時(shí)間體重、進(jìn)食量、飲水量測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠體重從第4 周開始顯著降低(P< 0.05 或P< 0.01),進(jìn)食量和飲水量均從第8 周開始顯著增加(P< 0.05 或P< 0.01);C組大鼠體重在第14 周時(shí)顯著增加,進(jìn)食量在第12 周時(shí)顯著降低,飲水量在第4、12 周時(shí)顯著降低,均具有顯著性差異(P< 0.05 或P< 0.01)(圖2)。

2.3 大鼠不同時(shí)間抓力測定結(jié)果

結(jié)果顯示,B 組大鼠第 0 周、4 周、8 周的抓力值與A 組比較無顯著性差異,從第8 周開始抓力呈降低趨勢,第12、14 周時(shí)大鼠抓力顯著低于A 組(P<0.01);C 組大鼠第 0、4、14 周的抓力與 A 組比較無顯著性差異,第8、12 周的抓力顯著低于與A 組(P<0.01)(圖3)。

2.4 大鼠呼吸頻率和脈搏幅度測定結(jié)果

結(jié)果顯示,從第0 周開始至第14 周,B 組大鼠呼吸頻率逐漸減弱,第14 周時(shí)呼吸頻率顯著低于A 組(P< 0.01);與A 組比較,B 組大鼠脈搏幅度在第8周、14 周時(shí)顯著降低(P< 0.01)。C 組大鼠第0 ～ 12周時(shí)呼吸頻率逐漸降低,第14 周時(shí)升高,與A 組比較始終無顯著性差異;第4 周時(shí)大鼠脈搏幅度降低,第8～14 周保持不變,與A 組比較,第14 周時(shí)C 組大鼠脈搏幅度顯著高于A 組(P< 0.05)(圖4)。

2.5 大鼠舌象分析結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠舌象的R、G、B值均顯著降低(P< 0.05 或P< 0.01);C 組大鼠舌象的 R 值顯著低于 A 組(P< 0.05),G、B 值與 A 組比較無顯著性差異(圖5)。

2.6 大鼠血糖測定結(jié)果

結(jié)果顯示,第4 周時(shí)(STZ 注射前),B 組大鼠的隨機(jī)血糖、空腹血糖與A 組比均無顯著性差異;第6～14 周,B 組大鼠的隨機(jī)血糖、空腹血糖均顯著高于A 組(P< 0.01)。與 A 組比,第 6 ～ 12 周時(shí),C 組大鼠隨機(jī)血糖顯著升高(P< 0.05 或P< 0.01);第10 周時(shí)空腹血糖顯著升高(P< 0.05),其余時(shí)間與A 組大鼠空腹血糖比較均無顯著性差異(圖6)。

注:與 A 組比較,*P< 0.05,??P< 0.01。(下圖同)圖1 大鼠一般狀態(tài)評分觀察Note. Compared with group A, *P< 0.05, ??P< 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Observation of general status score of rats

圖2 大鼠不同時(shí)間體重、進(jìn)食量和飲水量測定結(jié)果Figure 2 Measurement results of weight, food intake and water intake of rats at different times

圖3 大鼠不同時(shí)間抓力測定結(jié)果Figure 3 Grasping force measurement results of rats at different times

圖5 大鼠舌象分析結(jié)果Figure 5 Analysis results of tongue image of rats

圖6 大鼠血糖測定結(jié)果Figure 6 Measurement results of blood glucose in rats

2.7 大鼠尿糖檢測結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠3 次尿糖檢測結(jié)果均顯著升高(P<0.01);C 組大鼠3 次尿糖檢測結(jié)果與A 組比較均無顯著性差異(圖7)。

2.8 大鼠糖耐量測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠灌胃葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖值均顯著升高(P< 0.01),B 組AUC 顯著高于 A 組(P< 0.01);C 組大鼠灌胃后120 min 血糖值顯著高于A 組(P< 0.01),其余時(shí)間點(diǎn)的血糖值及AUC 與A 組比較均無顯著性差異(圖8)。

2.9 大鼠凝血功能指標(biāo)測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與 A 組比較,B 組大鼠 PT、APTT 均顯著減少(P< 0.05 或P< 0.01),C 組大鼠 PT、APTT 均無顯著性差異(圖9)。

2.10 大鼠血清TC、TG、LDL-C 指標(biāo)測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高(P< 0.01);C 組大鼠TG 含量顯著升高(P< 0.01),TC、LDL-C 含量無顯著性差異(圖10)。

圖7 大鼠尿糖檢測結(jié)果(n=8)Figure 7 Urine glucose detection results of rats(n=8)

圖8 大鼠糖耐量測定結(jié)果(n=8)Figure 8 Measurement results of glucose tolerance in rats(n=8)

圖9 大鼠凝血功能指標(biāo)測定結(jié)果(n=8)Figure 9 Measurement results of coagulation function indexes in rats(n=8)

圖10 血清TC、TG 和LDL-C 指標(biāo)測定結(jié)果(n=8)Figure 10 Measurement results of serum TC, TG and LDL-C indexes(n=8)

2.11 大鼠血清 cAMP、cGMP 含量及 cAMP/cGMP 測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清中cAMP含量和cAMP/cGMP 比值均顯著升高(P< 0.05 或P< 0.01);C 組大鼠血清中cGMP 含量顯著低于A組,cAMP/cGMP 比值顯著高于A 組,均有顯著性差異(P< 0.01)(圖11)。

圖11 血清cAMP、cGMP 含量測定結(jié)果(n=8)Figure 11 Determination of cAMP and cGMP in serum(n=8)

2.12 大鼠血清 CD4、CD8 含量及 CD4/CD8 測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠血清中CD4含量和CD4/CD8 比值均顯著降低(P< 0.05 或P<0.01);C 組大鼠血清中 CD4 含量顯著降低(P<0.05)(圖12)。

圖12 大鼠血清CD4、CD8 含量測定結(jié)果(n=8)Figure 12 Determination of CD4 and CD8 in serum of rats(n=8)

2.13 大鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果

結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P< 0.01),C 組大鼠胸腺指數(shù)無顯著性差異(圖13)。

圖13 大鼠胸腺指數(shù)測定結(jié)果(n=8)Figure 13 Measurement results of thymus index in rats(n=8)

2.14 大鼠胰腺組織HE 染色結(jié)果

結(jié)果顯示,A 組大鼠的胰腺組織內(nèi)可見體積較大的胰島組織,形態(tài)圓,分布數(shù)量較多,間質(zhì)疏松;細(xì)胞胞漿充盈正常,未見細(xì)胞空泡變性,未見細(xì)胞固縮現(xiàn)象。

與A 組比較,B 組大鼠胰腺組織內(nèi)極少見到胰島組織分布,胰島數(shù)量顯著減少;殘存胰島組織體積較小,其內(nèi)細(xì)胞數(shù)量顯著減少,細(xì)胞胞漿含量顯著減少,可見細(xì)胞固縮現(xiàn)象,表明STZ 導(dǎo)致動(dòng)物胰腺內(nèi)胰島組織損傷,胰島形態(tài)明顯改變,功能明顯下降。

與A 組比較,C 組大鼠胰腺組織內(nèi)胰島數(shù)量顯著增多,體積較大,形態(tài)圓,細(xì)胞胞漿豐富,胞漿量增多;少數(shù)胰島細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,提示動(dòng)物需要增強(qiáng)胰島功能,增加胰島細(xì)胞分泌量,以滿足機(jī)體對胰島所產(chǎn)內(nèi)分泌激素的需求(圖14)。

圖14 大鼠胰腺組織病理結(jié)果Figure 14 Histopathological results of pancreas in rats

3 討論

辨證施治是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治病的精髓,如何在基礎(chǔ)研究中突出中藥的治療特點(diǎn)一直是中藥藥效研究亟待解決的問題,病證結(jié)合動(dòng)物模型及其評價(jià)方法的建立可以較好地解決這一問題。本文通過高糖高脂飼養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素制備2 型糖尿病大鼠模型,根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中2型糖尿病氣陰兩虛證候的臨床表現(xiàn),我們嘗試設(shè)計(jì)了相應(yīng)的動(dòng)物體征采集表,對動(dòng)物在糖尿病發(fā)展過程中的癥狀、體征表現(xiàn)盡量做到定量客觀化描述,以此建立一個(gè)可操作的2 型糖尿病氣陰兩虛病證結(jié)合動(dòng)物模型及其評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

中醫(yī)臨床通過“望聞問切”的方法對病證進(jìn)行判斷,本實(shí)驗(yàn)以模擬中醫(yī)臨床表現(xiàn)為原則,嘗試將四診法轉(zhuǎn)換為大鼠體征的采集方法,并著重于望診信息的采集。氣陰兩虛是糖尿病的核心病機(jī),貫穿糖尿病病程發(fā)展的始末[7]。糖尿病患者飲食多肥厚油膩,易積食氣滯,脾胃郁結(jié),脾胃受損則無以消化精微,致體內(nèi)運(yùn)化失常,陰虛陽盛,陽氣升而體內(nèi)熱,內(nèi)熱久積而傷陰,陰精虧虛而耗氣,消渴日久,循環(huán)往復(fù),耗氣傷陰,致氣陰兩虛[8]。臨床認(rèn)為氣陰兩虛型2 型糖尿病表現(xiàn)為咽干口燥,倦怠乏力,多食易饑,口渴喜飲,氣短懶言,舌紅少津液,脈細(xì)數(shù)無力;將臨床表現(xiàn)與大鼠體征、評價(jià)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相對應(yīng),通過記錄客觀指標(biāo),觀察體征變化,對模型進(jìn)行評價(jià)。

首先通過對動(dòng)物一般狀態(tài)進(jìn)行評分反映大鼠運(yùn)動(dòng)、精神狀態(tài)的變化特點(diǎn),分值越高,動(dòng)物一般狀態(tài)越差,以此說明大鼠倦怠懶言的體征特點(diǎn)越明顯;通過對抓力、呼吸、脈搏等進(jìn)行測定,抓力值降低,說明大鼠出現(xiàn)乏力狀態(tài),呼吸、脈搏減弱,表明大鼠出現(xiàn)氣短、脈細(xì)無力等體征改變。

舌象的觀察。血液在脈絡(luò)中的正常運(yùn)行取決于體內(nèi)氣的充盈和推動(dòng),氣虛不足則推力弱,致血流不暢;作為血液的載體,脈絡(luò)還需要陰液的滋養(yǎng),陰液缺乏會(huì)導(dǎo)致脈絡(luò)阻滯,血液瘀阻,故氣陰兩虛日久生瘀。試驗(yàn)結(jié)果顯示,與A 組比較,B 組大鼠舌象的 R、G、B 值均顯著降低,R、G、B 值減小,表明舌體顏色變暗;舌體顏色呈暗紫色,表現(xiàn)為瘀證。說明在模型制備過程中,B 組大鼠可能表現(xiàn)為氣陰兩虛夾瘀[9-11]。

進(jìn)食量和飲水量的觀察。中醫(yī)臨床氣陰兩虛具有咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲的證候表現(xiàn),我們通過監(jiān)測進(jìn)食飲水量來反映這種體征。試驗(yàn)顯示,B 組的進(jìn)食量、飲水量較A 組顯著增加,結(jié)合血糖、尿糖、糖耐量等糖尿病基礎(chǔ)檢測指標(biāo)的測定,也可綜合評價(jià)2 型糖尿病氣陰兩虛證動(dòng)物模型的證候表現(xiàn)。

內(nèi)源性和外源性凝血功能APTT、PT 的觀察。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣為血之帥,血為氣之母,氣不足無以攝血;陰虛則血脈不充,血流運(yùn)行不暢。氣陰兩虛則致瘀血阻滯,血凝速度加快。結(jié)果顯示,B 組APTT、PT 較A 組明顯縮短,說明可能出現(xiàn)瘀血阻滯,間接反映機(jī)體處于氣陰兩虛狀態(tài)[12-13]。

血脂的觀察。氣陰兩虛時(shí)脾胃損傷不能升清降濁,可誘發(fā)“痰濁”,痰飲內(nèi)阻致血液粘稠而瘀血內(nèi)生,血流不暢致氣化失常而留滯成痰,故TC、TG和LDL-C 是中醫(yī)痰濁評價(jià)的重要生化指標(biāo)[14-15]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,B 組 TC、TG 和 LDL-C 值均升高;即在血糖代謝異常同時(shí)出現(xiàn)了血脂代謝異常;既反映了2 型糖尿病的特點(diǎn),又符合氣陰兩虛,痰濁內(nèi)生的機(jī)體狀態(tài)。

免疫功能的觀察。氣虛由于機(jī)體元?dú)獠蛔?氣的推動(dòng)、固攝、運(yùn)化、溫煦等功能減退,或臟腑機(jī)能減退,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)為免疫功能紊亂[16]。胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官,CD4、CD8 細(xì)胞屬于機(jī)體免疫細(xì)胞—T 淋巴細(xì)胞的亞群,二者數(shù)量及比例平衡是保持體內(nèi)免疫功能穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。上述指標(biāo)都是評價(jià)機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)[17-18]。結(jié)果顯示,與 A 組比較,B 組大鼠胸腺指數(shù)、CD4、CD4/CD8 值均明顯降低,從而反映機(jī)體可能處于氣陰兩虛狀態(tài)。

cAMP 和 cGMP 的觀察。cAMP、cGMP 是反映體液免疫功能的重要指標(biāo),其含量可影響機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌功能[19-20]。研究表明,陰虛時(shí)機(jī)體交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能偏高,表現(xiàn)為第二信使cAMP 活性升高,而cAMP/cGMP 比值升高較單一cAMP 升高更具特異性[21]。結(jié)果顯示,B 組 cAMP、cAMP/cGMP 值均顯著高于A 組,說明機(jī)體陰虛狀態(tài)顯現(xiàn)。

總結(jié)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,病證模型動(dòng)物的體征表現(xiàn)可概括為:精神萎靡,行動(dòng)遲緩,進(jìn)食量、飲水量增加,抓力降低,呼吸、脈搏減弱,舌體顏色呈暗紫色等;反映了臨床2 型糖尿病氣陰兩虛證中咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲、倦怠乏力、氣短懶言、脈細(xì)無力、舌色暗紫等證候特點(diǎn);同時(shí)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)也出現(xiàn)了血糖、尿糖、糖耐量及 TC、TG、LDL-C 值均顯著升高,PT、APTT、胸腺指數(shù)顯著下降,cAMP 和 cAMP/cGMP 值顯著升高,CD4、CD4/CD8 值顯著降低,胰腺內(nèi)胰島組織損傷、功能顯著下降等變化,也輔助證明了B 組大鼠出現(xiàn)2 型糖尿病氣陰兩虛證臨床表現(xiàn)。而單純高糖高脂喂養(yǎng)14 周的大鼠各項(xiàng)指標(biāo)與 A 組比較,隨機(jī)血糖、TG、cGMP、CD4 及舌象的 R值等指標(biāo)有顯著性差異,其余各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果無顯著性差異,因此,認(rèn)為該模型還不能全面地反映出2 型糖尿病氣陰兩虛證的證候特點(diǎn)。

綜上,大鼠高糖高脂喂養(yǎng)4 周后腹腔注射STZ 40 mg/kg,繼續(xù)高糖高脂飼養(yǎng)至14 周制備的動(dòng)物模型可較好地反映2 型糖尿病氣陰兩虛證的特點(diǎn)。由此說明,通過對動(dòng)物體征指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測可反映中醫(yī)證候的發(fā)展過程,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行定量化描述可進(jìn)一步輔助驗(yàn)證病證結(jié)合動(dòng)物模型的成立及證候特點(diǎn)的表達(dá),二者結(jié)合有助于模型的評價(jià),同時(shí)也使模型評價(jià)更為直觀、客觀、可操作,標(biāo)準(zhǔn)更易于統(tǒng)一。