王 強，黃 攀，王倩倩，陳培華，馬 莉，房 丹，金文杰，秦愛建

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室 教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225001；2.揚州市畜牧獸醫(yī)站，揚州 225001；3.寶應(yīng)縣畜牧獸醫(yī)站，揚州225800）

葡萄球菌是引起奶牛乳房炎常見菌株，同時也是重要的人畜共患病原微生物[1]。紅霉素常用于葡萄球菌引起的感染的治療，紅霉素對于克林霉素具有誘導(dǎo)耐藥的作用，可導(dǎo)致克林霉素的臨床治療失敗。而傳統(tǒng)藥物敏感實驗并不能檢測出紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥情況，故而對于臨床紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的菌株需要額外做D環(huán)實驗進行檢測[2]。葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（如紅霉素）的主要耐藥機制為核糖體靶位點的修飾或外排泵機制[3]。外排泵機制由msrA基因編碼膜蛋白調(diào)節(jié)[4]，介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)脂類、鏈陽霉素B耐藥[5]靶位修飾機制由ermA、ermC等基因調(diào)節(jié)，編碼23S rRNA甲基化，減少核糖體與MLSB（macrolides，lincosamides，and type B streptogramins）藥物的結(jié)合，導(dǎo)致MLSB耐藥。MLSB耐藥是由于誘導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯上游序列弱化子結(jié)合，導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變，暴露核糖體結(jié)合位點翻譯erm甲基化酶。固有型MLSB耐藥（constitutive，cMLSB）[6]是由于5'上游序列發(fā)生缺失、重復(fù)及突變，導(dǎo)致甲基化酶固有型表達(dá)，誘導(dǎo)型MLSB（inducible MLSB，iMLSB）耐藥[7]表現(xiàn)為對14、15元大環(huán)內(nèi)酯（如紅霉素）耐藥，而對16元大環(huán)內(nèi)酯、林克酰胺類及B型鏈陽霉素敏感。為了解本地區(qū)流行的細(xì)菌的耐藥現(xiàn)狀及指導(dǎo)臨床用藥，本研究對已分離的218株葡萄球菌進行耐藥分析。

1 材料與方法

1.1 病料采集 江蘇揚州、沭陽、如皋等奶牛場乳房炎送檢牛奶樣品，使用移液器無菌吸取100μL，使用滅菌棉棒均勻涂布于綿羊血平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2 病原菌的鑒定 挑取平板的單菌落，再次劃線接種于綿羊血平板進行純化，37℃培養(yǎng)過夜。純化后的細(xì)菌平板挑取單菌落進行革蘭氏染色，油鏡觀察后，選擇革蘭氏陽性球菌的細(xì)菌進行下一步鑒定。使用以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）方法[8]鑒定菌種，簡稱MBT法。MBT法的原理在于使用甲酸裂解細(xì)菌的細(xì)胞壁后，基質(zhì)與菌體核糖體蛋白形成結(jié)晶后快速蒸發(fā)帶入氣相，且?guī)险姾珊螅す飧哳l轟擊核糖體蛋白形成蛋白信號被捕獲后與文庫進行比對，鑒定菌種。其中MBT法所使用的標(biāo)準(zhǔn)品BTS、基質(zhì)均由布魯克公司生產(chǎn)。挑取少量單菌落的細(xì)菌，均勻涂布于MALDI靶板孔上，加1 μL甲酸裂解細(xì)胞壁，自然干燥后再加1 μL基質(zhì)，自然干燥后將靶板放入MALDI-TF質(zhì)譜儀鑒定。

1.3 藥敏實驗與紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥實驗（D環(huán)實驗） 參考CLSI 2017標(biāo)準(zhǔn)，挑選表1抗生素藥敏紙片進行藥敏實驗。藥敏紙片購于杭州微生物試劑公司。

表1 藥敏紙片信息表Table1 The information of K-B papers

藥敏實驗使用K-B紙片法。D環(huán)實驗挑取紅霉素耐藥且克林霉素中介或者敏感的金黃色葡萄球菌的單菌落配置于0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木海?00 μL均勻涂布于MH平板上，按照CLSI 2017版標(biāo)準(zhǔn)進行操作與判讀。若克林霉素靠近紅霉素抑菌圈出現(xiàn)截平反應(yīng)時，則判讀D環(huán)實驗陽性，若抑菌圈無明顯形狀變化，則判讀D環(huán)實驗陰性。

1.4 耐藥基因檢測 主要檢測葡萄球菌中msrA、ermA、ermC三類基因。PCR引物序列與條件參考文獻[9]。PCR：使用購置于天根公司的細(xì)菌DNA試劑盒提取DNA，引物由華大基因合成。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性20s，55℃退火20s，70℃延伸45 s，35個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 葡萄球菌菌種鑒定結(jié)果 使用MBT法對分離菌種進行鑒定，結(jié)果可知，218份臨床分離葡萄球菌株中，金黃色葡萄球菌為58株、溶血性葡萄球菌13株、松鼠葡萄球菌36株、馬胃葡萄球菌11株、木糖葡萄球菌20株、表皮葡萄球菌20株。此外，還有蒼蠅葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、腐生葡萄球菌等其他葡萄球菌共計60株，見圖1。

圖1 各類葡萄球菌分離圖Fig.1 Diagram of staphylococcus isolates

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

2.2 葡萄球菌多重耐藥統(tǒng)計 通過對藥敏數(shù)據(jù)分析，得出細(xì)菌耐藥數(shù)據(jù)（圖2）。挑選13類抗生素共20種，分別為大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、克拉霉素；喹諾酮類：諾氟沙星、左氟沙星、環(huán)丙沙星；四環(huán)素類：米洛環(huán)素、四環(huán)素；林可霉素類：克林霉素；氯霉素類：氯霉素；多磷類：磷霉素；多肽類：多粘菌素B、替考拉寧；青霉素類：青霉素；頭孢菌素類：頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶；頭霉素類：頭孢西?。换前奉悾簭?fù)方新諾明；氨基糖苷類：大觀霉素；硝基呋喃類：呋喃妥因。以菌株對同一類抗生素耐藥情況統(tǒng)計，三重耐藥以上為多重耐藥，結(jié)果顯示，有74株葡萄球菌分離株呈現(xiàn)多重耐藥，見表3。

表3 218株葡萄球菌分離株對20種抗生素的藥敏結(jié)果Table 3 Susceptibility of 218 strains of Staphylococcus isolates to 20 antibiotics

圖2 耐藥統(tǒng)計表Fig.2 Drug resistance statistics

2.3 紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥實驗（D環(huán)實驗） 臨床奶樣分離得到葡萄球菌218株，其中金黃色葡萄球菌（SA）58株，凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）160株。K-B法藥敏試驗顯示，分離菌株均對頭孢西丁敏感，紅霉素耐藥率為10.7%（31/218），其中金黃色葡萄球菌1株、凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）30株。3株凝固酶陰性葡萄球菌（1株為頭葡萄球菌、2株為木糖葡萄球菌）表現(xiàn)為固有型MLSB耐藥，對紅霉素和克林霉素均耐藥。有21株葡萄球菌表現(xiàn)紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介。有6株葡萄球菌D環(huán)實驗呈現(xiàn)陽性。

圖3 D環(huán)實驗結(jié)果Fig.3 D-test results

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果 對上述6株葡萄球菌進行耐藥基因PCR檢測，結(jié)果顯示，以這6株葡萄球菌為模板均擴增到了大小為420 bp的條帶，與ermA基因大小一致，但未擴增到與ermC基因大?。?20 bp）一致的條帶，表明這些菌株均攜帶ermA基因而不攜帶ermC基因。

圖4 ermA基因PCR結(jié)果Fig.4 PCR results of ermA gene

3 討論

本研究分離所得的218株葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌占比26.61%，凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）占比高達(dá)73.39%，顯示凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）導(dǎo)致的奶牛隱性乳房炎在奶牛群中發(fā)病更為嚴(yán)重，與北京報道的病例[10]接近。對218株葡萄球菌耐藥性分析顯示，青霉素耐藥菌株達(dá)179株，占比超過82%，揭示了臨床抗生素的濫用使得耐藥性菌株數(shù)量大大增加。其中，臨床常用藥物如復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)19%，諾氟沙星耐藥率27%，環(huán)丙沙星耐藥率26%，頭孢他啶耐藥率達(dá)45%。多重耐藥主要表現(xiàn)在二重耐藥至四重耐藥之間，偶見超過七重耐藥的葡萄球菌，多種耐藥率為33.9%。與青海地區(qū)[11]對比，江蘇地區(qū)葡萄球菌菌株耐藥率低于青海地區(qū)菌株，頭孢噻肟的耐藥率也低于青海病例。與新疆地區(qū)[12]對比，新疆地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對頭孢西丁，耐藥率高達(dá)100%，而江蘇地區(qū)細(xì)菌分離株對頭孢西丁均表現(xiàn)為敏感，兩地差異較大，顯示了攜帶不同的耐藥元件。杜琳等[13]分析上海金黃色葡萄球菌分離株對頭孢西丁的耐藥率高達(dá)83.33%，與江蘇地區(qū)有較大差異。臨床常使用紅霉素軟膏進行奶牛乳頭保養(yǎng)，如同時使用克林霉素則有可能導(dǎo)致克林霉素耐藥，臨床使用這兩類藥物需要注意。同時應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果，注重青霉素的濫用的情況，及時參考藥敏實驗結(jié)果更換其他抗生素，推薦多種抗生素足量混合使用，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。近幾年，由于減抗養(yǎng)殖的推廣，魚腥草[14]、板藍(lán)根、蒲地藍(lán)等傳統(tǒng)中藥使用率提高，同時一些抑菌多肽[15]的應(yīng)用也減少了抗生素的使用，以上方法均可有效降低細(xì)菌耐藥性的增加。