吳文靜張昕譚霞解道豪楊明華李亞輝

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201)

蛋白激酶和磷酸酶調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平,已有的研究更多的是蛋白激酶對精子功能的調(diào)控,而磷酸酶對精子功能的調(diào)控研究報道較少,且在精子功能(如精子運動)調(diào)控中蛋白激酶與磷酸酶是否存在相互作用,其作用機制如何等均未被闡明。

在SRC 家族激酶(SRC family kinases,SFKs)中,最早發(fā)現(xiàn)的 SFKs 成員是 SRC 激酶[1-2]。Stival等[3]建立了Src基因敲除的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)Src基因敲除的小鼠精子活力顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制SRC 激酶會抑制小鼠獲能相關(guān)的酪氨酸磷酸化增加、改變精子運動性以及小鼠精子的頂體反應(yīng)[4]。

Ser/Thr 磷酸酶在由未成熟精子變成成熟精子過程中發(fā)生磷酸化,并且與精子運動性有密切聯(lián)系[5]。劉芳等[6]的研究表明小鼠精子中磷酸酶PP1γ2 和PP2A 對小鼠附睪精子成熟、運動性及精子獲能具有重要的調(diào)控作用,表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控的作用方式:即 PP1γ2 和 PP2A 活性高,精子運動性低,PP1γ2 和PP2A 活性低,則精子運動性高,但這種負(fù)調(diào)控機制至今不清楚。Signorelli 等[7]研究發(fā)現(xiàn)人精子中的PP1γ2 被抑制時,獲能精子數(shù)顯著增加。Ser/Thr 磷酸酶在獲能過程中酶活性呈下降趨勢,但其蛋白表達(dá)量不發(fā)生改變,這種磷酸酶活性的下降和隨后蘇氨酸磷酸化的增加可能是精子獲能成功的重要條件。Krapf 等[8]研究發(fā)現(xiàn)SRC 激酶抑制劑SU6656 或SKI606 能夠抑制小鼠精子獲能及獲能時發(fā)生的蛋白酪氨酸磷酸化,但Ser/Thr 磷酸酶抑制劑如 Okadaic acid 和 Calyculin-A 能夠消除 SU6656或SKI606 對小鼠精子獲能的抑制作用。表明Ser/Thr 磷酸酶抑制劑克服了SFKs 抑制劑對獲能相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻礙,這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括與精子獲能相關(guān)的超激活運動[8]。鑒于精子運動性是保證精子獲能的前提條件,且精子在獲能過程中伴隨著超激活運動,說明獲能中的一些分子及事件可能對精子運動產(chǎn)生影響,因此認(rèn)為:Ser/Thr 磷酸酶可能對精子的運動具有調(diào)控作用,且其作用可能與SRC 分子相關(guān),這一觀點在此之前并未得到證明。而且,磷酸酶對精子運動性的調(diào)控大多來自牛、犬、靈長類、倉鼠等物種的實驗,在小鼠上僅報道過其對精子超激活運動的調(diào)節(jié)[9-13]。SRC 激酶參與小鼠精子獲能的調(diào)控,Ser/Thr 磷酸酶是調(diào)控小鼠精子成熟、運動性獲得的關(guān)鍵酶,但目前都是從單個分子角度研究對小鼠精子獲能的調(diào)控,目前對Ser/Thr磷酸酶與SRC 激酶的關(guān)聯(lián)性研究僅限于Krapf等[8]這篇關(guān)于精子獲能的報道,Krapf 等[8]從精子獲能相關(guān)的參數(shù)研究了這兩者之間對小鼠精子獲能的調(diào)控作用,而精子獲能伴隨著精子超激活運動的發(fā)生,所以SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶可能會共同調(diào)控小鼠精子運動,為了獲得其精子運動性的調(diào)控以及精子成熟機理,為此,本研究探索了SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶之間的聯(lián)系對小鼠精子運動的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本試驗選用60 只8 ～12 周齡體重至少36 g 性成熟雄性清潔級昆明小鼠,由昆明醫(yī)科大學(xué)【SCXK(滇)2020-0004】提供。所有小鼠飼養(yǎng)在昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物樓【SYXK(滇)K2020-0006】,飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(22 ± 3)℃,相對濕度 40% ～ 70%,12 h 循環(huán)燈光,自由取食飲水。按照云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)的實驗方案進行(審批號:202005011)。

1.1.2 主要試劑

洗精液:NaCl、 KCl、 KH2PO4、 MgSO4、 Glucose、Pyruvic acid、lactic acid、Hepes(獲能液包含 CaCl2、NaHCO3、BSA)除 BSA 購自 Solarbio 公司,其它試劑均購自 Sigma 公司; SRC 抗體(Cell Signaling Technology,2108 s);phos-SRC 抗體(Cell Signaling Technology,59548 s); phos-Threonine 抗體(Cell Signaling Technology,#9386);PP1γ2 抗體(Abcam,ab134947);PP2A 抗體(Abcam,ab32104);sc-3052(Santa Cruz Biotechnology,sc-3052);SU6656(Med Chem Express,HY-B0789);洗精液參照文獻Tateno等[14]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 不同獲能時間對小鼠附睪頭和附睪尾精子中蘇氨酸磷酸化的影響

小鼠附睪精子在洗精液中游離出來后觀察精子活力并計數(shù),附睪頭精子懸液不孵育直接提取蛋白,附睪尾精子懸液按照 0、10、30、60、90 min 時間梯度孵育然后進行Western Blot 分析。

1.2.2 SRC 激酶在小鼠附睪頭和附睪尾精子中的存在形式

將小鼠附睪頭和附睪尾精子直接提取蛋白,然后進行Western Blot 分析。

1.2.3 SRC 激酶與 PP1γ2 和 PP2A 的免疫共沉淀分析

SRC 激酶與 PP1γ2 和 PP2A 的相互作用通過免疫共沉淀分析,具體的實驗操作步驟采用Stival等[3]的方法。

1.2.4 小鼠附睪頭和附睪尾精子磷酸酶活性分析

采用Jin 等[15]的方法對小鼠精子中磷酸酶活性進行分析。

1.2.5 SRC 抑制劑及激活劑分別對小鼠附睪尾和附睪頭精子磷酸酶活性和運動度影響

向小鼠附睪頭和附睪尾精子懸液分別加入50 μmol/L sc-3052 和 50 μmol/L SU6656,具體的實驗操作步驟采用Jin 等[15]的方法。

1.2.6 小鼠附睪頭和附睪尾精子中SRC 激酶活性的分析

小鼠附睪精子在洗精液中游離出來后觀察精子活力并計數(shù),具體的實驗操作步驟采用Leclerc等[16]的方法。

2 結(jié)果

2.1 不同獲能時間對小鼠附睪頭和附睪尾精子中蘇氨酸磷酸化的影響

小鼠附睪尾精子中蘇氨酸的磷酸化水平高于附睪頭精子,并且小鼠附睪尾精子在0 min 就開始磷酸化(見圖1)。結(jié)果表明,參與Ser/Thr 去磷酸化的Ser/Thr 磷酸酶在附睪頭精子中比在附睪尾精子中更活躍。

2.2 SRC 在小鼠附睪頭和附睪尾精子中的存在形式

附睪頭精子中SRC 激酶的非磷酸化水平明顯高于附睪尾精子。相反,在附睪頭精子中磷酸化的SRC 激酶(Y416 位點)的水平明顯低于附睪尾精子(見圖2)。一般來說,非磷酸化的SRC 激酶代表沒有或很少催化活性,而磷酸化的SRC(Y416 位點)具有較高的酶活性。因此,結(jié)果表明,SRC 激酶在附睪頭精子中的活性低于附睪尾精子。

2.3 SRC 激酶與 PP1γ2 和 PP2A 的免疫共沉淀分析

當(dāng)SRC 激酶抗體與精子懸液孵育時,可以沉淀SRC 激酶,并通過 Western Blot 檢測到 PP1γ2(圖3Aa)。相反,陰性對照組不加SRC 激酶抗體,通過Western Blot 沒有檢測到蛋白沉淀(圖3Ab)。結(jié)果表明 SRC 激酶與 PP1γ2 相互作用。當(dāng) SRC 激酶抗體與精子懸液孵育時,可以沉淀SRC 激酶,并通過Western Blot 檢測到 PP2A(圖3Ba)。相反,陰性對照組不加SRC 激酶抗體,通過Western Blot 沒有檢測到蛋白沉淀(圖3Bb)。這些結(jié)果表明SRC 激酶與PP2A 相互作用。

2.4 小鼠附睪頭和附睪尾精子磷酸酶活性分析

為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果,分別用0.5 × 106和1.0× 106細(xì)胞檢測了附睪頭和附睪尾精子的磷酸酶活性。對比結(jié)果如圖4 所示,表明無論精子細(xì)胞數(shù)量多少,附睪頭精子的磷酸酶活性都明顯高于附睪尾精子,差異具有顯著性(P< 0.05)。

圖1 不同獲能時間對小鼠附睪頭和附睪尾精子中蘇氨酸磷酸化的影響Figure 1 Threonine phosphorylation in mouse sperm from the caput and cauda of epididymis

圖2 SRC 與phos-SRC 在小鼠附睪頭和附睪尾精子中的存在形式Figure 2 Present form of SRC in mouse sperm from the caput and cauda of epididymis

圖3 SRC 與 PP1γ2 和 PP2A 的免疫共沉淀分析Figure 3 Co-immunoprecipitation analysis of SRC with PP1γ2 and PP2A

注:圖中相同精子數(shù)條件下,與附睪尾比,bP< 0.05。圖4 昆明小鼠附睪頭和附睪尾精子磷酸酶活性分析Note. This is the same sperm count compared to caudal epididymis,bP< 0.05.Figure 4 Analysis of phosphatase activity in caput and cauda sperm of mouse epididymis

2.5 SRC 抑制劑對小鼠附睪尾精子磷酸酶活性和運動度的影響

對照組是成熟的附睪尾精子,當(dāng)磷酸酶受到抑制或活性降低時,精子表現(xiàn)出較高的活力。然而,當(dāng)SRC 激酶抑制劑SU6656 添加到附睪尾精子中孵育30 min,磷酸酶活性增加,而精子的運動度與對照組相比顯著降低(P< 0.05)(見圖5),表明SRC 激酶對磷酸酶有抑制作用,SRC 激酶通過抑制附睪尾精子的磷酸酶活性來調(diào)控精子運動度。這也表明,即使在精子成熟且運動活躍的附睪尾中,精子的運動度也是通過SRC 激酶、磷酸酶等某些酶活性的改變而可逆的。同時表明SRC 激酶、磷酸酶及其相互作用在調(diào)節(jié)精子運動中起著關(guān)鍵作用。

2.6 SRC 激活劑對小鼠附睪頭精子磷酸酶活性和運動度的影響

對照組是運動度較低的附睪頭精子,但磷酸酶活性較高。然而,將SRC 激酶的激活劑sc-3052 添加到附睪頭精子中孵育30 min,磷酸酶活性降低,而精子運動度與對照組相比顯著增加(P< 0.05)(見圖6),說明與附睪尾精子不同,SRC 激酶在附睪頭精子中不活躍或活性較低,并釋放磷酸酶活性,導(dǎo)致精子不運動或運動度降低。在附睪頭精子中添加sc-3052 可以提高SRC 激酶活性,隨后降低磷酸酶活性,從而證實了這一推斷。

2.7 sc-3052 對小鼠附睪頭精子中SRC 激酶活性的影響

當(dāng)SRC 激酶的底物enolase 與附睪頭精子孵育時,enolase 組SRC 激酶活性明顯高于非enolase 組。此外,在精子懸液中添加SRC 激酶激活劑sc-3052,SRC 激酶活性明顯升高(見圖7),說明SRC 激酶在附睪頭精子中是不活躍或活性很低,被sc-3052 激活活性升高。

2.8 SU6656 對小鼠附睪尾精子中SRC 激酶活性的影響

當(dāng)SRC 激酶的底物enolase 與附睪尾精子孵育時,enolase 組SRC 激酶活性明顯高于非enolase 組。相反,在精子懸液中添加SRC 激酶抑制劑SU6656,SRC 激酶活性明顯下降(見圖8)。SRC 激酶在附睪尾精子中的活性高于附睪頭精子(與圖7 相比)。

注:與對照組比,bP< 0.05。(下圖同)圖5 SRC 激酶抑制劑對小鼠附睪尾精子磷酸酶活性和運動度影響Note.Compared with control group, bP< 0.05.(The same in the following figures)Figure 5 Effects of SRC inhibitor on sperm phosphatase activity and motility in cauda sperm of mouse epididymis

圖6 SRC 激酶激活劑對小鼠附睪頭精子磷酸酶活性和運動度影響Figure 6 Effects of SRC activator on phosphatase activity and motility in caput sperm of mouse epididymis

3 討論

研究顯示Ser/Thr 磷酸酶PP1γ2/PP2A 在不運動的小鼠附睪頭精子中的催化活性遠(yuǎn)高于具有運動能力的附睪尾精子,且通過化學(xué)藥物干預(yù)抑制或激活這兩種磷酸酶可以使精子運動度發(fā)生顯著變化,表明 Ser/Thr 磷酸酶 PP1γ2/PP2A 在精子運動的啟動和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,這與其他物種上(如牛,靈長類等)的研究結(jié)果“磷酸酶對附睪精子成熟具有調(diào)控作用”一致[5,17]。此外本研究結(jié)果首次表明了 Ser/Thr 磷酸酶 PP1γ2/PP2A 的活性受 SRC 激酶的調(diào)節(jié)控制。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠附睪頭精子中SRC 激酶活性低于附睪尾精子,且精子運動度低于附睪尾精子,而Ser/Thr 磷酸酶活性高于附睪尾精子,在運動度較低的附睪頭精子中加入SRC 激酶激活劑sc-3052,能顯著降低Ser/Thr 磷酸酶活性但顯著提高精子運動度,在運動度較高的附睪尾精子中加入SRC 激酶抑制劑SU6656,能顯著增加Ser/Thr 磷酸酶活性但顯著降低精子運動度,表明SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶之間可能具有某種相互作用從而調(diào)控小鼠精子運動,且通過免疫共沉淀分析得到SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶PP1γ2/PP2A 具有關(guān)聯(lián)性作用,其可能是這二者都參與調(diào)控精子運動性,結(jié)合其Ser/Thr磷酸酶活性以及運動度分析,表明SRC 激酶通過抑制小鼠精子Ser/Thr 磷酸酶活性從而調(diào)控小鼠精子運動度,其作用機制可能是小鼠精子在從附睪頭轉(zhuǎn)移至附睪尾的過程中,SRC 激酶活性增強,抑制了其Ser/Thr 磷酸酶活性,通過其Ser/Thr 磷酸酶活性變化而實現(xiàn)對精子運動的調(diào)控作用。未成熟精子從附睪頭到附睪尾最終成為成熟精子,這個過程精子活力逐漸增強,而Ser/Thr 磷酸酶活性逐漸下降,因此Ser/Thr 磷酸酶活性變化與精子運動性有關(guān)[7]。從 Krapf 等[8]的研究表明,SRC 激酶抑制劑可以阻斷小鼠精子獲能相關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸化,但Ser/Thr 磷酸酶抑制劑能夠消除SRC 激酶抑制劑對獲能的影響,包括體外受精。這似乎暗示了SRC激酶與Ser/Thr 磷酸酶具有某種關(guān)聯(lián)性。本研究證明小鼠精子中Ser/Thr 磷酸酶PP1γ2/PP2A 與SRC激酶確實存在相互作用,且SRC 激酶通過調(diào)控Ser/Thr 磷酸酶的活性而對小鼠精子運動作出調(diào)控,即SRC 激酶通過抑制Ser/Thr 磷酸酶而提高小鼠精子的運動能力。本研究首次為精子中SRC 激酶和磷酸酶間存在互作關(guān)系之推測提供了直接的證據(jù)。研究所發(fā)現(xiàn)的小鼠精子中SRC 激酶對Ser/Thr 磷酸酶具有抑制作用這一現(xiàn)象與SRC 激酶在其它細(xì)胞中的作用結(jié)果相一致,此前,有研究證明SRC 激酶可以下調(diào)其它細(xì)胞的Ser/Thr 磷酸酶[18-19]。SRC 激酶在不同種類細(xì)胞中對Ser/Thr 磷酸酶具有相似的調(diào)控作用,說明SRC 激酶作用機制的通用性。

探明SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶之間的聯(lián)系對小鼠精子運動性的調(diào)控作用,有助于獲得小鼠附睪尾精子成熟和運動的機理,還能豐富SRC 激酶與Ser/Thr 磷酸酶對小鼠精子運動性調(diào)控的研究內(nèi)容以及作用機制,為相關(guān)男性不育癥的理解和診治提供科學(xué)依據(jù)。

圖7 sc-3052 對小鼠附睪頭精子中SRC 激酶活性的影響Figure 7 Effect of sc-3052 on SRC kinase activity in epididymal caput sperm

圖8 SU6656 對小鼠附睪尾精子中SRC 激酶活性的影響Figure 8 Effect of SU6656 on SRC kinase activity in epididymal cauda sperm

本研究雖然闡明了SRC 激酶和Ser/Thr 磷酸酶PP1γ2/PP2A 的相互作用及其對精子運動的調(diào)控作用,但其中仍有一些問題并不清楚,如SRC 激酶活性的調(diào)節(jié)受控于何種分子、SRC 激酶和Ser/Thr 磷酸酶之間是直接作用還是通過其他分子起作用、是何分子、何種磷酸酶(PP1γ2 還是 PP2A 或 PP2B)起作用、磷酸酶失活(被抑制)后又是如何引發(fā)精子運動的,其下游的信號通路是什么等,這些重要問題的解答將有助于深入理解Ser/Thr 磷酸酶對精子運動精細(xì)調(diào)控作用機制及較為完整的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,它們可作為磷酸酶與精子功能關(guān)系領(lǐng)域中未來的重點研究內(nèi)容,其中一些內(nèi)容正在本實驗室中進行。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)小鼠附睪頭精子中SRC 激酶活性低于附睪尾精子而Ser/Thr 磷酸酶活性顯著高于附睪尾精子,研究表明小鼠附睪精子中 SRC 激酶與PP1γ2/PP2A 具有相互作用,呈負(fù)相關(guān)性,即 SRC激酶通過抑制精子中Ser/Thr 磷酸酶活性以調(diào)控精子運動。