高代代,冉軍艦,趙功玲,阮曉莉,劉劍橋,段旭

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

乳酸菌是能夠利用糖類,發(fā)酵產(chǎn)物主要為乳酸的革蘭氏陽性菌的總稱,呈桿狀或球狀[1].乳酸菌能夠通過多種生物代謝途徑在人體內(nèi)發(fā)揮生理功能,如維持對人體有益的腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡,促進(jìn)腸道對營養(yǎng)大分子的分解和吸收,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,抗癌和抗腫瘤,延緩衰老,降低膽固醇的作用[2].除此之外,乳酸菌在食品應(yīng)用中能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì),受到廣大群眾的喜愛,在開發(fā)新型功能性食品中發(fā)揮著重要的作用.

我國蘋果資源比較豐富,但是蘋果飲料相對較少,通過乳酸菌發(fā)酵可以改變蘋果的風(fēng)味,增加營養(yǎng)價值,延長保存期,滿足不同人群對蘋果的需求[3].并且乳酸菌發(fā)酵在豐富營養(yǎng)價值的同時還可以產(chǎn)生特殊的風(fēng)味物質(zhì),如醇、醛、酸、酯和硫化物等[4-7].除此之外,蘋果果皮作為一種天然的抗氧化物具有很強(qiáng)的抗氧化活性,與果肉以及同類的果蔬相比,蘋果果皮的抗氧化性能更高,這可能是由于蘋果果皮中含有較豐富的表兒茶素、原花青素等酚類物質(zhì)[8-10].

蘋果汁營養(yǎng)豐富、益于健康、是人體獲得維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)補(bǔ)給的重要來源之一.除含有大量水分外,蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物占有較大比例.目前,發(fā)酵型蘋果汁屬于新興的飲品,這種飲品營養(yǎng)價值較高,不僅能夠改善蘋果汁的口感和功效,還可利用這種發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行護(hù)膚品的生產(chǎn)研制[11].與西方國家相比,我國在蘋果汁的發(fā)酵工藝還不夠完善,因此發(fā)展我國蘋果汁發(fā)酵技術(shù)迫在眉睫[12].

以紅富士蘋果為主要原料,利用四種混合乳酸菌來混合發(fā)酵蘋果汁,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝.本文以期為發(fā)酵果蔬飲料研發(fā)提供新思路和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：紅富士蘋果（糖度質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%、pH值4.42）、伊利百利包、蔗糖購自世紀(jì)華聯(lián)超市;嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnos us）均為河南科技學(xué)院食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株.

試劑：磷酸氫二鉀、抗壞血酸、乙酸鈉、魚蛋白胨、乳糖、酒石酸鉀鈉、硫酸錳等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

Model PHS-3C pH計(jì),上海盛磁儀器有限公司;SW-CJ-1D單人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺,蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;JYZ-E5V九陽原汁機(jī),九陽股份有限公司;ZHWY-211恒溫培養(yǎng)振蕩器,智城分析儀器制造有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果汁的制備 蘋果清洗去核后切成果肉小丁榨汁,加入少量的抗壞血酸防止發(fā)生酶促褐變,置于轉(zhuǎn)速為2 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min,上清液置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌15 min,冷凍待用（-20℃）.

1.3.2 菌種的活化 將所需菌種劃線37℃恒溫培養(yǎng),挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)16 h.以2%的接種量相同條件再次活化,作為試驗(yàn)發(fā)酵種子液[13].

1.3.3 菌種馴化活化菌液→牛奶蘋果汁(m牛奶∶m蘋果汁=9∶1)→培養(yǎng)→牛奶蘋果汁(m牛奶：m蘋果汁=7∶3)→培養(yǎng)→牛奶蘋果汁(m牛奶：m蘋果汁=5∶5)→培養(yǎng)→牛奶蘋果汁(m牛奶：m蘋果汁=3∶7)→培養(yǎng)→牛奶蘋果汁(m牛奶：m蘋果汁=1∶9)→培養(yǎng)→純蘋果汁→培養(yǎng)[14]

1.3.4 發(fā)酵劑的制備 馴化后的植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的接種量分別接入到含有50 mL蘋果汁的250 mL錐形瓶中,37℃恒溫環(huán)境中以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12 h;嗜酸乳桿菌按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入到50 mL的蘋果汁中,37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)12 h;嗜熱鏈球菌按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入到50 mL的蘋果汁中,40℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)12 h[15].

1.3.5 蘋果汁發(fā)酵工藝流程 在1.3.1蘋果汁制備的基礎(chǔ)上,確定乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的工藝流程,工藝流程如下：

1.3.6 單因素試驗(yàn) 參照1.3.5蘋果汁發(fā)酵工藝流程,將蘋果汁和無菌水共50 mL置于250 mL錐形瓶中,蔗糖1.5 g[16],接種配比為1∶1∶1∶1.

1.3.6.1 蘋果汁添加量的確定 在一定發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑接種量和發(fā)酵時間下,將蘋果汁按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%、30%、35%的比例,添加到無菌水中進(jìn)行發(fā)酵,測定不同蘋果汁的添加量對發(fā)酵蘋果汁感官評分的影響.

1.3.6.2 發(fā)酵溫度的確定 在蘋果汁的添加量、發(fā)酵劑的接種量和發(fā)酵時間一定的條件下,分別在25、30、35、40、45℃下發(fā)酵,測定不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果汁的感官評分的影響.

1.3.6.3 發(fā)酵劑接種量的確定 在蘋果汁添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度一定的條件下,分別接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%的發(fā)酵劑,測定發(fā)酵劑的不同接種量對發(fā)酵蘋果汁的感官評分影響.

1.3.6.4 發(fā)酵時間的確定 在蘋果汁添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑接種量一定的條件下,分別發(fā)酵25、30、35、40、45 h,測定不同發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果汁的感官評分影響.

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用Box Behnken模型,以果汁添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵劑的接種量（C）、發(fā)酵時間（D）為自變量（分別以-1,0,1代表自變量的中、低、高3個水平）；以感官評分為響應(yīng)面值,選擇蘋果汁發(fā)酵的最佳條件[17].

1.3.8 蘋果汁感官評定標(biāo)準(zhǔn) 感官評定采用評估檢驗(yàn)法,評定小組對成品進(jìn)行評分,總分100分.取平均分作為感官評定的結(jié)果.評定細(xì)則見表1.

表1 感官評分細(xì)則Tab.1 Detailed rules for sensory scoring

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次,單因素方差分析采用SPSS 19.0軟件;以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn).

1.5 測定方法

1.5.1 pH值測定 使用Model PHS-3C型pH計(jì)測定.首先對pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn),取100 mL發(fā)酵的蘋果汁倒入錐形瓶中加熱煮沸10 min（排出CO2）,自然冷卻,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容.將pH計(jì)兩電極插入待測蘋果汁,按下讀數(shù)開關(guān),穩(wěn)定1 min,pH計(jì)指針?biāo)竝H值即為果汁飲料pH值[18].

1.5.2 還原糖含量測定 采用直接滴定法[19]測定發(fā)酵產(chǎn)品中的還原糖含量.取出待測發(fā)酵蘋果汁除去蛋白質(zhì),以亞甲基藍(lán)作為指示劑,在加熱條件下滴定堿性酒石酸銅溶液,根據(jù)消耗的體積計(jì)算還原糖含量.

1.5.3 乳酸菌活菌計(jì)數(shù) 活菌計(jì)數(shù)采用傾注平板計(jì)數(shù)法測定[20].首先制備蘋果汁的質(zhì)量濃度梯度.適當(dāng)稀釋樣品分別移入平皿中,注入46℃營養(yǎng)瓊脂,進(jìn)行三個重復(fù),然后將平板放在37℃培養(yǎng)48 h,測菌落數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蘋果汁添加量對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響 蘋果汁添加量對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響結(jié)果見圖1.

圖1 蘋果汁添加量對發(fā)酵蘋果汁感官評分的影響Fig.1 Effect of apple juice addition on sensory evaluation of fermented apple juice

由圖1可知,蘋果汁添加量在15%～35%范圍內(nèi),隨著蘋果汁添加量的增加,發(fā)酵蘋果汁的感官評分先升高后降低.當(dāng)蘋果汁添加量為30%時,發(fā)酵蘋果汁的感官評定最高,由此確定成品的理想果汁添加量為30%.

2.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響結(jié)果見圖2.

圖2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果汁感官品評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of fermented apple juice

由圖2可知,發(fā)酵溫度在25～35℃范圍內(nèi),隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵蘋果汁的感官評分先升高后降低勢.當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時,發(fā)酵蘋果汁的感官評定最高,由此確定成品的理想發(fā)酵溫度為35℃.

2.1.3 發(fā)酵劑接種量對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響 發(fā)酵劑接種量對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響結(jié)果見圖3.

圖3 發(fā)酵劑接種量對發(fā)酵蘋果汁感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on sensory evaluation of fermented apple juice

由圖3可知,發(fā)酵劑的接種量在1%～5%范圍內(nèi),隨著發(fā)酵劑接種量的增加,發(fā)酵蘋果汁的感官評分先升高后降低.當(dāng)發(fā)酵劑接種量為2%時,發(fā)酵蘋果汁的感官評定最高,由此確定成品的理想發(fā)酵劑接種量為2%.

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響 發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果汁感官品質(zhì)的影響結(jié)果見圖4.

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果汁感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of fermented apple juice

由圖4可知,發(fā)酵時間在25～45 h,隨著發(fā)酵時間的增長,發(fā)酵蘋果汁的感官評分先升高后降低.當(dāng)發(fā)酵時間為35 h時,發(fā)酵蘋果汁的感官評定最高,由此確定成品的理想發(fā)酵時間為35 h.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.2.1 優(yōu)化結(jié)果與方差分析 將表2數(shù)據(jù)運(yùn)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到感官評分（Y）對蘋果汁添加量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、發(fā)酵劑接種量（X3）、發(fā)酵時間（X4）的回歸方程為：Y=-588.83+10.09X1+9.27X2+4 2.61X3+18.42X4+0.11X1X2+0.50X1X3-005X1X4-0.24X2X3+0.06X2X4-0.21X3X4-0.22X12-0.20X22-10.29X32-0.27X42.由回歸方程可知,發(fā)酵劑接種量對成品感官評分影響最大.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理Tab.2 Response surface test design and data processing

（續(xù)表2）

感官評分的方差分析見表3.

表3 感官評分的方差分析Tab.3 Analysis of variance of sensory score

由表3可知,模型P＜0.000 1,說明影響顯著,失擬項(xiàng)為0.339 8,說明干擾因素影響不顯著.模型決定系數(shù)R2為0.987 4,說明響應(yīng)值的實(shí)際值和預(yù)測值間擬合度較好,可用于分析預(yù)測產(chǎn)品的最優(yōu)工藝.通過方差分析可發(fā)現(xiàn)：X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42均呈極顯著影響（P＜0.01）,X3、X1X4、X2X3呈顯著影響（P＜0.05）,其它項(xiàng)不顯著.就影響程度而言,發(fā)酵時間＞發(fā)酵劑接種量.

2.2.2 各因素交互作用分析 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面圖見圖5.

圖5 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of factors on sensory score

由圖5可知,感官評分隨著各因素的增加先升高后降低.其中發(fā)酵時間對感官評分的影響最大.圖5A、5B、5C、5D、5E等高線形狀為橢圓形,說明交互作用顯著.圖5F等高線形狀為圓形,表明二者交互作用不顯著,與方差分析結(jié)果一致.

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 優(yōu)化后最佳工藝為蘋果汁添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,發(fā)酵溫度35℃,發(fā)酵劑接種量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,發(fā)酵時間34 h,在該條件下感官評分預(yù)測值為83.32分.為驗(yàn)證該結(jié)果,在此條件下進(jìn)行5次試驗(yàn)得到感官評分為82.44±0.25分,與預(yù)測值接近.因此通過響應(yīng)面方法得到的最佳工藝條件較可靠.

2.3 測定結(jié)果

采用最優(yōu)配方發(fā)酵蘋果汁,測定其pH值、還原糖、活菌數(shù)、結(jié)果見表4.

表4 發(fā)酵后測定結(jié)果Tab.4 Determination results after fermentation

3 結(jié)論

本文利用嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵蘋果汁,通過單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平,以感官評定為檢測指標(biāo),得到發(fā)酵產(chǎn)品的最佳工藝條件：蘋果汁添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,發(fā)酵溫度35℃,發(fā)酵劑接種量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,發(fā)酵時間35 h.得到產(chǎn)品的感官評分82.44分,pH值為3.45,糖度質(zhì)量濃度5.5%,活菌數(shù)6.64×108CFU/mL.