何麗華,孫永祥,戚亞江

(1.杭州市蕭山區(qū)疾病預防控制中心，杭州 311201； 2.杭州華源豆制品有限公司，杭州 311201)

1 引言

自2020年伊始，新冠肺炎疫情在全球蔓延已成為國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，截止2021年2月17日已造成全球242.7萬人死亡，嚴重威脅人類生命與健康，且疫情仍在延續(xù)，新冠肺炎疫情對社會及各行業(yè)帶來嚴重影響，如原材料、勞動力等生產(chǎn)要素流通受阻，物流、生產(chǎn)、銷售等正常經(jīng)營活動受到嚴重干擾，居民消費阻滯，引發(fā)全球經(jīng)濟秩序嚴重破壞。因人類對新冠肺炎病毒缺乏足夠認知以及正確的防護，導致疫情傳播范圍廣，時間長，給疫情國家人民生活工作帶來巨大影響。疫情的大規(guī)模爆發(fā)，似乎新冠肺炎病毒無處不在，以致國內(nèi)外多地冷鏈食品也出現(xiàn)新冠肺炎病毒檢測陽性。如2020年11月-12月，從青島黃島海關入關的進口冷凍去骨牛肉臀腰肉心外包裝樣品有3份檢測結果呈陽性；濟南市疾控中心在蓋世物流園區(qū)冷庫貯存的進口冷凍食品及包裝標本中檢測出新冠病毒核酸陽性；等等。被污染的食品像一個導火索，在一個沒有疫情的或已經(jīng)控制本地疫情傳播的地方，人因接觸被污染的食品而感染，產(chǎn)生新的“零號病例”，從而觸發(fā)新的疫情。大量科學數(shù)據(jù)表明，食品不會感染新冠病毒，但有可能被污染，一是受到含有病毒的水、包裝材料的污染，二是受到攜帶病毒的食品加工者污染。食品源繼發(fā)的疫情為疫情防控帶來新的難題，防止食品被污染是切斷疫情傳播的重要途徑之一。因此，疫情背景下對食品的防腐殺菌及衛(wèi)生防護提出新的挑戰(zhàn)。

豆腐是全民通用的日常食品之一，新鮮豆腐的運輸儲存如同冷凍的牛肉、海產(chǎn)品一樣，也遵照冷鏈運輸管理，由于豆腐中蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等含量豐富，且水分含量高，病毒、細菌等微生物在此條件下很容易繁殖而被污染，豆腐被污染途徑多種多樣。在豆腐制作過程中，大豆原料、加工輔料、生產(chǎn)用具、儲存包裝等多個環(huán)節(jié)都有可能被污染，雖然尚未發(fā)現(xiàn)豆制品樣品出現(xiàn)新冠病毒檢測陽性，但是，傳統(tǒng)的豆腐防腐殺菌方法可能不一定滿足疫情環(huán)境下的衛(wèi)生防護需求，且食用豆腐的人群量大、面廣，因此疫情背景下探討豆腐的防腐殺菌及衛(wèi)生防護對疫情防控具有重大的現(xiàn)實意義。

豆制品富含有人體必須的氨基酸、低聚糖、不飽和脂肪酸、膳食纖維、卵磷脂、腦磷脂、鈣、磷、鐵等無機鹽和各種維生素等營養(yǎng)豐富易消化[1]。我國大豆制品的生產(chǎn)歷史悠久，但生產(chǎn)工藝水平不高，產(chǎn)品保鮮期短。隨著人們飲食觀念的改變，以植物性食物為膳食模式的重新建立，大豆制品尤其豆腐越來越受到人們的青睞，因此，對傳統(tǒng)大豆制品豆腐的生產(chǎn)技術的改造，提高豆制品防腐保鮮及衛(wèi)生防護，防止食品源疫情傳播，勢在必行[2]。

2 材料與方法

2.1 材料

(1)豆腐加工：市售當日生產(chǎn)的盒裝豆腐，杭州華源豆制品有限公司生產(chǎn)；加工工藝流程為:豆腐→保鮮液浸泡→包裝→殺菌→冷卻→成品。

(2)抽樣：從杭州華源豆制品有限公司生產(chǎn)線上無菌操作隨機取下4盒共2000克作為樣品。保鮮液浸泡：用研究選定的保鮮液浸泡30 min,保證保鮮液能充分進入豆腐中[1]。

(3)試劑：① 尼泊金酯類防腐劑(即對羥基苯甲酸酯類，包括尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯):上海五聯(lián)化工廠；② 山梨酸鉀:國藥集團化學試劑有限公司；③ API20E腸桿菌科和非腸道革蘭氏陰性菌鑒定條:法國梅里埃公司;④ API staph葡萄球菌和微球菌鑒定條:法國梅里埃公司;⑤ BAC芽孢桿菌鑒定卡:法國梅里埃公司;⑥ 檸檬酸鹽、糖類等微量生化鑒定管:杭州天和微生物試劑公司；⑦ 氧化酶試紙:杭州微生物試劑有限公司;⑧ 10%過氧化氫:上海遠大過氧化物有限公司。

2.2 儀器和設備：

① GNP9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；② SSW型微電腦電熱恒溫水浴箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；③ Bagmixer樣品均質(zhì)儀：法國INTERSCIENCE公司；④Labpro樣品稀釋儀：美國Spiral Biotech公司；⑤ VITK32全自動微生物分析系統(tǒng)：法國梅里埃公司；⑥ YXQ-LS50L立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

2.3 方法

2.3.1 殺毒殺菌試驗:

新冠肺炎病毒、食品細菌等微生物在高溫下大多數(shù)能滅活，豆腐樣品2盒1000克采用高溫水浴(溫度82℃,時間30 min)殺毒殺菌，然后冷卻至40～50℃,緩解豆腐在高溫和高濕度下過度變性析水。

2.3.2 抑菌試驗

防腐保鮮劑的抑菌試驗設5種濃度，即在5組(每組3只)滅菌平皿中分別加入1.6%濃度抑菌劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml,然后依次加入生理鹽水0.8、0.6、0.4、0.2、0 ml,每皿各加入菌液1 ml,混勻后各加入45℃營養(yǎng)瓊脂14ml輕輕混勻，對應每一平皿抑菌劑濃度分別為0.2/1000、0.4/1000、0.6/1000、0.8/1000、1.0/1000。待平皿內(nèi)瓊脂凝固后置36℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況并計數(shù)菌落(N),計算最低抑菌濃度抑菌率。計算公式：(10000-N)/10000*100%。

2.3.2 腐敗菌分離、鑒定

將殺毒后的盒裝豆腐樣品，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至豆腐腐敗，對主要的腐敗菌進行分離，純化，操作如下：在無菌工作臺上，將豆腐盒表面用75%的酒精消毒后從豆腐的不同表面取豆腐25g,加入等量的無菌生理鹽水，在研缽中研磨成均勻的懸濁液。以10-1，10-2,10-3,10-4的稀釋液中分別取1.0 ml菌懸液放在培養(yǎng)皿中，倒入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻。平板于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，在24、48、72 h后觀察菌落形態(tài)并計數(shù)(以下同)。選擇培養(yǎng)皿中出現(xiàn)最多的菌落，然后從10-3或10-4稀釋度的培養(yǎng)皿中用接種環(huán)挑出少許，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離，于37℃培養(yǎng)48 h，取出后觀察菌落形態(tài)，反復用平板劃線法分離直至成為單一菌。將分離、純化后的菌株接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在4～6℃的冰箱中保存。在鑒定前接種到斜面培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48h。鑒定的依據(jù)和條件如下：細菌的分類、鑒定遵照伯杰氏系統(tǒng)的細菌學手冊。

2.3.4 新冠肺炎病毒(2019-nCoV)核酸檢測： ①采集標本。殺毒殺菌后的豆腐樣品，采用咽拭子法在外包裝盒子前、中、后三個部位擦拭采集標本，同時切取豆腐上、中、下三個部位黃豆大小的豆腐塊為標本，采集后樣本放入有編號的無菌試管密閉。②樣本預處理滅活病毒。用75%的酒精消毒，再進行溫度為56°水浴30分鐘，使病毒滅活，再常溫靜置20分鐘，。③樣本裂解。取560 μl AVL裂解液到1.5 ml無菌EP管中，加入5.6 μl配制好的CarrierRNA，再加入已經(jīng)滅活的140 μl樣本(咽拭子或豆腐塊)，混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中核酸。將EP管瞬時離心后加入560 μl無水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時離心后備用。吸取630 μl裂解產(chǎn)物，加入至離心柱中，8000rpm離心1分鐘，轉移離心柱至新收集管，將剩余的630μl裂解產(chǎn)物加到離心柱中，重復上述離心操作。④ 提取核酸。64通道的自動提取樣本，加入到反應板，通過提取儀進行核酸提取。⑤試劑盒檢測。采用上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)進行自動檢測，(儀器注冊號20203400057)

2.3.5 保鮮效果評價方法：樣品2盒1000克經(jīng)0.3g/kg濃度尼泊金丁酯浸泡30 min結合82℃ 30 min的巴氏殺毒殺菌綜合防腐保鮮處理后，在37℃下保存，每天觀察，觀察7天，保鮮評價內(nèi)容包括感官評價[3]、微生物評價[4]和質(zhì)構分析[5]。

3 結果

3.1 殺毒殺菌

樣品經(jīng)高溫水浴(溫度82℃,時間30 min)殺毒殺菌后，外包裝及豆腐樣本新冠肺炎病毒(2019-nCoV)核酸檢測均呈陰性(見表1)。

表1 豆腐殺毒后新冠肺炎病毒檢測結果

3.2 豆腐的防腐抑菌

豆腐殺毒殺菌后是否能保鮮儲存關鍵在于其腐敗菌的生長活性，本研究選用尼泊金酯類和山梨酸兩種防腐劑對比觀察其抑菌效果，見表2 、表3。

表2 尼泊金酯類的抑菌試驗比較

表3 山梨酸的抑菌試驗

根據(jù)以上抑菌試驗，我們可發(fā)現(xiàn)各防腐劑對某些細菌有效，某些細菌無效。這和國內(nèi)報道山梨酸用于豆制品保鮮效果不盡一致。由于豆制品污染的腐敗菌不同導致不同保鮮劑的不同效果，山梨酸[6-7]均對霉菌、需氧菌效果較好，但對厭氧性芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌等細菌不敏感。尼泊金酯[6]的防腐效果克服了國內(nèi)常見防腐劑山梨酸的作用弱且對兼氣性芽孢性芽孢形成菌和嗜酸乳桿菌幾乎無效以及有PH值影響較大的缺點，從以上豆腐的腐敗菌和各防腐劑的抑菌試驗結果可以認為尼泊金酯類特別是尼泊金丁酯是較理想的豆腐防腐保鮮劑。

3.3 豆腐中腐敗菌的分離鑒定

抑菌試驗后進行菌落培養(yǎng)，對培養(yǎng)的菌落鏡檢，篩選出菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)不同的4株腐敗菌df1、df2、df3、df4(見表4)。

表4 豆腐腐敗菌菌落形態(tài)學特征

根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版)[8]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]對4株腐敗菌進行分類鑒定。4個腐敗菌株的生理生化特征見表5-表7。

表5 菌株df1的生理生化特征

續(xù)表5

表6 菌株df2、df4的生理生化特征

續(xù)表6

表7 菌株df3的生理生化特征

續(xù)表7

由表4、表5可知，df1菌株為產(chǎn)氣腸桿菌，據(jù)表4、表6判斷df2菌株為松鼠葡萄球菌， df4菌株為木糖葡萄球菌，由據(jù)表4、表7判斷df3菌株為梭形芽孢桿菌。

3.4 保鮮效果評價

依據(jù)豆腐腐敗菌的菌種，有理由選擇尼泊金丁酯高敏感性防腐劑。豆腐樣本經(jīng)殺毒殺菌及尼泊金丁酯防腐保鮮劑處理，在37℃的恒溫箱下保存，每天觀察，進行微生物評價、感官評價和質(zhì)構分析方法。

3.4.1 尼泊金丁酯對豆腐中微生物的影響。采用MPN法 (most probable number,最大可能數(shù)) 來估算細菌濃度，觀察不同濃度尼泊金丁酯對豆腐微生物學指標的影響，結果見表8、表9。

表8 0.2g/kg濃度尼泊金丁酯對豆腐微生物的影響

表9 0.3g/kg濃度尼泊金丁酯對豆腐微生物的影響

表8可知，經(jīng)過0.2 g/kg濃度尼泊金丁酯保鮮液浸泡處理，密封包裝殺菌的豆腐在37℃保存第3天，就有大量的微生物繁殖，這和前面的抑菌研究相一致，說明在0.2 g/kg濃度下還能使部分細菌繁殖。表9的結果表明，0.3 g/kg的保鮮劑溶液浸泡處理，密封包裝殺菌的豆腐中，37℃保存7天，細菌總數(shù)和大腸菌群近似值均達到出廠衛(wèi)生標準[9]。0.3 g/kg濃度尼泊金丁酯防腐保鮮效果更理想。

3.4.2 對豆腐質(zhì)構的影響

豆腐經(jīng)殺菌殺毒以及防腐保鮮技術處理后，必須要保證食品物理結構不能遭受破壞，包括其硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼型、破裂性等，經(jīng)食品TPA質(zhì)構分析(Texture Profile Analysis，TPA)，結果見表10。

表10 豆腐TPA質(zhì)構分析結果

表10可知，防腐保鮮殺毒處理后的豆腐硬度、膠粘性、咀嚼性、彈性、內(nèi)聚性、回彈性和破裂性無顯著變化。

4 討論

我國豆腐的加工及防腐保鮮技術長期以來比較穩(wěn)定成熟，不論南豆腐、北豆腐均能滿足國家衛(wèi)生標準要求。由于新冠肺炎疫情突然出現(xiàn)，且食品源疫情偶有發(fā)生，迫使我們加強食品衛(wèi)生監(jiān)督與防范。傳統(tǒng)豆腐制作過程中再增加殺毒殺菌，必然涉及防腐劑的選擇與成本核算。為了保證豆腐的食品營養(yǎng)價值及感官性能不變的要求，本文嘗試新的豆腐防腐保鮮技術，為防止食品源疫情選擇新的合理的豆腐防腐保鮮劑提供科學依據(jù)。

4.1 豆腐腐敗菌的類型及其來源

豆腐制作工藝流程基本相同：大豆原料→洗豆→泡豆→磨漿→濾漿→煮漿(出口溫度120℃)→冷卻→豆腐→保鮮液浸泡→包裝→殺菌(82℃殺菌時間30min)―?冷卻→成品。豆腐是不經(jīng)發(fā)酵過程制成的食品，其中水分含量高，是最容易腐敗的非發(fā)酵豆制品[10]。而盒裝豆腐的生產(chǎn)，是采用機械化、自動化的生產(chǎn)技術，為了減少二次污染，最大限度地排除干擾因素，本研究以盒裝豆腐為研究對象，探討盒裝豆制品腐敗微生物及其保鮮技術。

豆腐營養(yǎng)豐富，水份含量高，非常有利于微生物的繁殖，即使盒裝豆腐在夏天的保質(zhì)期也不過1天，冬天(0-4℃)不超過3天，極易腐敗變質(zhì)[11]。對豆腐中主要腐敗菌的鑒定以及保鮮技術研究，國內(nèi)外的文獻報道并不多，且結論也不一致。鄧勇、滕剛[11]等人對萄糖酸一δ一內(nèi)酯(GDL)豆腐中腐敗菌進行了分離鑒定，認為GDL豆腐中的主要腐敗菌為耐熱性的枯草芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌，其數(shù)量分別占總菌數(shù)的75%和15%。劉興玲等[12]認為豆制品的腐敗主要因霉菌、酵母、乳酸菌還有厭氧桿菌引起的。Tuitemnwong K和Fung DYC[13]研究了在7℃貯藏1天和30天后的7種品牌的傳統(tǒng)豆腐及滲出汁液中的腐敗菌，認為豆腐的腐敗根據(jù)豆腐物理性質(zhì)和初始的微生物而改變。所分離的微生物中，最普遍的革蘭氏陽性菌為鏈球菌屬、片球菌屬、乳桿菌，最普遍的革蘭氏陰性菌為綠膿假單胞菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)氣桿菌、陰溝腸桿菌。Hegeman GD等[14]研究了石膏豆腐(真空包裝)在2-3℃貯存的腐敗微生物。貯藏30天后，豆腐中的主要腐敗菌為乳酸菌、腸道菌和假單胞菌屬。Dotson 等[15]認為豆腐的腐敗是由乳酸菌引起的，并提出了一種測量豆腐腐敗的方法。對于防腐劑的選擇應用也不相同。林桂蕓、曾心禮等人[16]認為豆制品主要腐敗是因真菌和酵母引起的，所以采用山梨酸鉀和大蒜對其進行防腐抑菌?？妆ＨA和遲玉生等[17]認為豆制品主要為乳酸菌，所以選擇乳酸鏈球菌素來防腐保鮮。肖凱、賴本麗等人[18]采用雙乙酸鈉、山梨酸鉀、大蒜汁進行保鮮。由于引起豆制品腐敗的主要微生物研究結論不盡相同，國內(nèi)外對豆制品的保鮮技術的報道也有很大區(qū)別[19-20]，使之對豆制品防腐保鮮技術的方法也沒有一致的結論，而腐敗菌的確定是研究保鮮技術的基礎。因此，本研究只能依據(jù)當?shù)囟垢母瘮【囵B(yǎng)鑒定來選擇敏感的防腐保鮮技術。

植物蛋白類產(chǎn)品中微生物菌相主要來源于土壤和空氣中的浮游芽孢桿菌、水源細菌和人畜糞便細菌，如芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌。豆制品成品中微生物的來源主要有原料、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程、生產(chǎn)操作人員和運輸過程等[21]。李博等[10]認為盒裝豆腐中的腐敗菌種為堅強芽孢桿菌和屎腸球菌，其最初來源是大豆原料。Hegeman GD 等[14]研究真空包裝的豆腐2℃-3℃貯存時，主要的腐敗微生物為乳酸菌腸道菌和假單胞菌，其中腐敗微生物可能是由生產(chǎn)過程中帶入的。Tuitemwong,K and Fung,D.Y.C等[13]研究了在7℃貯存1天和3天后豆腐中的腐敗菌，認為豆腐腐敗依據(jù)其物理性質(zhì)和初識的微生物而不同。最普遍的G+微生物為鏈球菌屬，乳桿菌屬，片球菌屬；最普遍的G-微生物為綠膿假單胞菌，惡臭假單胞菌等。雖然豆腐腐敗菌的來源各種報道有些出入，但肯定一點微生物如假單胞菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、乳酸菌及成團腸桿菌等絕大部分微生物在煮漿(120℃)及熱凝固(118℃)過程中被殺死[22],所以鄧勇等人對盒裝豆腐腐敗菌鑒定為枯草芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌。本研究根據(jù)豆腐腐敗菌分型鑒定，表明浙江本地盒裝豆腐中的腐敗菌主要為梭形芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌。依據(jù)腐敗菌的生長屬性可以推測豆腐中的梭形芽孢桿菌屬主要來源于大豆原料，產(chǎn)氣桿菌、松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌主要來源于生產(chǎn)過程由設備帶入以及制作后期的豆腐相接觸二次污染所致。

4.2 豆腐的防腐保鮮劑選擇

根據(jù)豆腐的腐敗菌分析，豆腐中最普遍存在微生物絕大部分在煮漿及熱凝固中被殺死，不易殺死的芽孢桿菌和由設備帶入的或制作后期豆腐接觸人員污染的產(chǎn)氣桿菌、松鼠葡萄球菌以及新冠病毒等必需采用其他綜合防腐保鮮技術。為了使保鮮豆腐在產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)不發(fā)生變劣及不被污染，保持新鮮豆腐品質(zhì)，保鮮劑的選擇必須是廣譜及對芽孢桿菌敏感。苯甲酸鈉和山梨酸是目前國內(nèi)食品業(yè)中最普遍的廣譜化學防腐劑，但是0.lg/kg的苯甲酸鈉加入食品后便可嘗出異味，而且當PH>4時，抑菌效果會明顯下降[23],因此苯甲酸鈉不適合用于豆制品。山梨酸是一種高效低毒的化學防腐劑，其防腐效果在PH值在5-6范圍較理想，且無異味[24]。豆腐的保存過程中，由于產(chǎn)酸微生物的繁殖會導致PH值下降，會影響其防腐保鮮劑抑菌效應，但是國內(nèi)也有報道其對豆腐的防腐的效果較好[16,18]。所以可將山梨酸作為備選防腐劑。目前國際上常用尼泊金酯類作為防腐劑，但是國內(nèi)很少用。尼泊金酯類防腐劑主要有4種：尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯，從理論上看[6]，尼泊金酯類防腐劑具有使用量小，毒性小等優(yōu)點。因此，本次研究主要采用后期保鮮方法對己制成的新鮮豆腐進行保鮮處理，基于豆腐主要腐敗菌PH值以及國內(nèi)外使用防腐劑的研究成果，擬選用山梨酸、以及尼泊金甲、乙、丙、丁酯進行防腐保鮮抑菌試驗，期望能尋找到一種科學合理的豆制品防腐保鮮劑。

本次研究經(jīng)山梨酸、尼泊金甲、乙、丙、丁酯的防腐保鮮對比試驗，結果表明，山梨酸均對霉菌、需氧菌效果較好，但對厭氧性芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌等細菌不敏感。尼泊金酯的防腐效果克服了山梨酸的抑菌作用弱且對兼氣性芽孢性芽孢形成菌和嗜酸乳桿菌幾乎無效以及有PH值影響較大的缺點，綜合分析，豆腐高溫殺毒后經(jīng)0.3g/kg的尼泊金丁酯防腐保鮮劑溶液浸泡處理，結合密封包裝殺菌，37℃保存7天，細菌總數(shù)和大腸菌群近似值均達到出廠衛(wèi)生標準[9]，TPA質(zhì)構分析效果良好。因此，選擇0.3g/kg濃度尼泊金丁酯作為防腐保鮮劑較為理想。

5 結論

本研究認為盒裝豆腐增加高溫殺毒殺菌可以滿足疫情檢驗衛(wèi)生需求。豆腐腐敗微生物很可能是耐熱性的芽孢桿菌和由設備帶入以及制作后期所接觸污染所致。尼泊金丁酯能有較好的抑菌作用，是豆制品較為理想的保鮮劑。選用0.3 g/kg濃度的尼泊金丁酯浸泡豆腐30 min,并結合82℃,30 min的巴氏殺菌處理，能在37℃環(huán)境下保存7天，并無質(zhì)構明顯變化。