陸小亮，吳 彬，陳科濟(jì)，李愛軍，范 飛

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院特需治療科三病區(qū)，上海 200438

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）也被稱為外周型膽管癌、膽管癌之肝內(nèi)型，是肝內(nèi)膽管被覆上皮發(fā)生的、起源于肝段膽管一直到赫令膽管上皮的一種原發(fā)性癌癥，被定義為源于Ⅱ級(jí)以遠(yuǎn)的肝內(nèi)膽管病變［1］。肝內(nèi)膽管癌惡性程度高、癥狀隱慝，早期難以被發(fā)現(xiàn)，根治性切除機(jī)會(huì)較少，且發(fā)展迅速，預(yù)后不佳、死亡率高，近年來其發(fā)病率不斷上升［2］。肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制目前尚不明確。本研究通過免疫組化、免疫印跡、PCR 方法測定S100A7 在肝內(nèi)膽管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，并分析其與肝內(nèi)膽管癌臨床相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集上海東方肝膽外科醫(yī)院2018 年1 月—2020年1月收治的30例肝內(nèi)膽管癌患者患者，男17例，女13 例。按國際抗癌聯(lián)盟TNM 分期屬Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ-Ⅳ期19例。所有患者均未行化療、放療和靶向、免疫治療。

納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床影像學(xué)診斷為肝內(nèi)膽管癌，首診于我院。排除標(biāo)準(zhǔn)：無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無手術(shù)禁忌?；颊呒凹覍倬g(shù)前已簽訂我院標(biāo)本供醫(yī)學(xué)研究使用告知同意書，本研究經(jīng)上海東方肝膽外科倫理會(huì)審核并批準(zhǔn)?；颊呔懈蝺?nèi)膽管癌根治術(shù)。術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌。

1.2 方法

運(yùn)用免疫組化和real-timePCR、免疫印跡的實(shí)驗(yàn)方法檢測S100A7 的蛋白和mRNA 在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)情況：新鮮液氮凍存的組織樣本，分成2 份，一份提取蛋白，一份提取RNA。采用Invitrogen 公司的免疫組化試劑盒對(duì)30 例樣本進(jìn)行蛋白水平的檢測；蛋白裂解液裂解組織，4 ℃下離心，獲取上清、蛋白變性20 min；與細(xì)胞裂解液進(jìn)行12%的SDS-PAGE 電泳，ECL 發(fā)光試劑盒顯影、曝光，分析蛋白表達(dá)量；TRizol 抽提組織中的總RNA，設(shè)計(jì)針對(duì)S100A7 的特異引物，對(duì)反轉(zhuǎn)錄cDNA 進(jìn)行real-time PCR 反應(yīng)，以β-actin 為內(nèi)參，檢測S100A7的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Fisher 精確概率法、Linear-by-Linear Association法、Pearson Chi-square 法對(duì)S100A7 表達(dá)與相關(guān)臨床相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

免疫組化檢測的30 例肝內(nèi)膽管癌組織S100A7表達(dá)水平。結(jié)果顯示，癌組織中S100A7 染色強(qiáng)度、陽性百分比和Quickscore 均顯著高于癌旁組織，見圖1。

圖1 S100A7在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)（免疫印跡法）Fig.1 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（Western blotting）

2.2 免疫印跡

為驗(yàn)證免疫組化結(jié)果，我們用免疫印跡法檢測了30 例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中S100A7 表達(dá)水平。結(jié)果癌組織S100A7 蛋白表達(dá)水平亦明顯高于癌旁組織，見圖2。

2.3 qRT-PCR

為進(jìn)一步驗(yàn)證S100A7 是否在肝內(nèi)膽管癌高表達(dá)，我們用定量PCR檢測了30例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中S100A7 mRNA 表達(dá)。結(jié)果癌組織中S100A7 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。見圖3。

2.4 S100A7表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌臨床病理的相關(guān)性

本研究分析了30 例肝內(nèi)膽管癌S100A7 表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。S100A7表達(dá)與浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TMN 分級(jí)存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），但與患者患者的性別、年齡、淋巴管侵犯、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

3 討論

肝內(nèi)膽管癌是一種惡性程度高，較難早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后很差的惡性腫瘤。其發(fā)生可能與某些因素相關(guān)［3］如肝內(nèi)膽管結(jié)石［4］、膽管分支（膽管樹）形態(tài)異常、慢性感染、放射性核素及石棉、亞硝酸胺等化學(xué)性物質(zhì)［5-6］。目前臨床上應(yīng)用的幾個(gè)檢查指標(biāo)如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原199（CA199）［7-9］、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP）等為肝內(nèi)膽管癌的腫瘤標(biāo)志物，雖有一定特異度和靈敏度，但總體而言尚缺乏有效的臨床診治、預(yù)后判斷的分子靶標(biāo)，且相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。

我們前期通過高通量基因表達(dá)譜篩選、芯片檢測及生物信息學(xué)分析，篩查出肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞存在一個(gè)顯著變化的分子即S100A7（S100 calcium binding protein A7）。本文在這基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化、免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)一步檢測驗(yàn)證，并分析與肝內(nèi)膽管癌患者的臨床病理相關(guān)性。免疫組化、免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測結(jié)果均顯示，S100A7 在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；而且發(fā)現(xiàn)，S100A7 在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)與腫瘤浸潤深度（T1、T2對(duì)T3、T4，P=0.027）、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0對(duì)N1-2，P=0.014）、TNM 分級(jí)（Ⅰ、Ⅱ期對(duì).Ⅲ、Ⅳ期，P=0.021）呈正相關(guān)，提示肝內(nèi)膽管癌S100A7 表達(dá)越高，其腫瘤浸潤越嚴(yán)重，淋巴結(jié)越易轉(zhuǎn)移，TNM 分期越晚，患者預(yù)后越差；但與性別、年齡、淋巴管轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。

圖2 S100A7在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)（免疫組化）Fig.2 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（immunohistochemistry）

圖3 S100A7 在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)（qRT-PCR）Fig.3 The expression of S100A7 mRNA in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells（qRT-PCR）

S100A7也稱銀屑病素，最早是在銀屑病皮膚病變中被分離和發(fā)現(xiàn)的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約11 400的低分子量蛋白，屬S100家族［10］。該家族的典型結(jié)構(gòu)特征是有兩個(gè)螺旋基元（helix-loop-helix）組成的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)（calcium-binding site）［11］。在S100蛋白家族中，有22個(gè)家族成員在1號(hào)染色體21位基因座（locus）位置形成基因簇（cluster）［12］，其中也包括S100A7。S100家族成員在細(xì)胞內(nèi)、外均起重要的生理功能，包括鈣離子平衡、增殖、凋亡、侵襲/運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架變化、轉(zhuǎn)錄等［13］。作為S100 家族的成員，S100A7 除了上述兩個(gè)具有家族特征的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)外，還有一個(gè)特有鋅結(jié)合位點(diǎn)（zinc-binding site），該位點(diǎn)可能是介導(dǎo)S100A7特異性功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［14］。據(jù)報(bào)道，S100A7參與了眾多上皮來源的惡性腫瘤［15］包括子宮癌［16］、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［17-19］的 發(fā) 生、發(fā) 展 過 程，如S100A7 通 過 調(diào) 控Hippo-YAP 通 路 促 進(jìn) 肺 癌 發(fā) 生 發(fā) 展［18］。而 且，S100A7 表達(dá)受表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號(hào)通路的調(diào)控，并參與該信號(hào)通路的調(diào)控［20］。我們團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道，microRNA-26b-5p（miR-26b-5p）可通過抑制S100A7的過度表達(dá)抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移［21］。然而，關(guān)于S100A7 在肝內(nèi)膽管癌中的功能和分子機(jī)制研究以及與臨床病理相關(guān)性，罕有報(bào)道。本文結(jié)果，S100A7 在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞高表達(dá)，且與腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分級(jí)相關(guān)，提示可能參與了肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展；在臨床上開展檢測S100A7 表達(dá)，可能助于了解肝內(nèi)膽管癌患者的預(yù)后。如若進(jìn)一步研究S100A7及其下游信號(hào)通路分子抑制劑，有望開發(fā)針對(duì)性的靶向藥以改善患者不良預(yù)后。

表1 肝內(nèi)膽管癌S100A7表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性Tab.1 Relationship between S100A7 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma and clinicopathological parameters