李武平，李婕，劉宗義，易南，黃思琦，朱付平

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，常繼發(fā)于動脈損傷、動脈栓塞、擠壓綜合征、斷肢再植、帶血管蒂組織移植等疾病。目前醫(yī)學(xué)界對缺血-再灌注損傷的防治研究仍主要集中在心、肝、腦、腎等重要臟器，對LIRI缺乏特異性治療，療效不穩(wěn)定，對LIRI的分子病理機制亦尚未完全闡明。Ca2+超載及炎癥反應(yīng)是內(nèi)臟重要器官缺血-再灌注損傷的重要病理機制。前期研究表明，活血化瘀類中藥可調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白表達(dá)，減少LIRI骨骼肌細(xì)胞的凋亡[1]；同時研究發(fā)現(xiàn)，適量桃紅四物湯（含0.075、0.15 g原藥材/mL）預(yù)處理對LIRI大鼠骨骼肌具有保護作用，且呈量效關(guān)系，而濃度過高（含0.3 g原藥材/mL）不僅未出現(xiàn)理想的量效關(guān)系，反而加重骨骼肌損傷[2]；體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)損傷大鼠骨骼肌細(xì)胞，三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptor，IP3R）表達(dá)顯著上調(diào)，桃紅四物湯預(yù)處理通過調(diào)控Wnt/Ca2+信號通路中Wnt5a/IP3R途徑減輕腓腸肌成肌細(xì)胞損傷[3]，其中IP3R作為一種化學(xué)門控的Ca2+釋放通道，其過度激活是誘發(fā)Ca2+超載，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一[4]?；诖?，本研究制備大鼠LIRI模型，以IP3R上游信號分子Wnt5a阻滯劑作為陽性對照，觀察桃紅四物湯對大鼠LIRI骨骼肌IP3R表達(dá)的影響，進(jìn)一步從Wnt5a/Ca2+信號通路角度探討大鼠LIRI骨骼肌損傷機制及桃紅四物湯的干預(yù)作用，為豐富LIRI的病理機制和防治方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雄性大鼠80只，SPF級，2月齡，體質(zhì)量（230±10）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，動物使用許可證號SYXK（湘）2019-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心無病原體設(shè)施，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%，光照12 h，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物

桃紅四物湯（桃仁15 g，紅花15 g，熟地黃10 g，赤芍10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科結(jié)合現(xiàn)代工藝加工制成藥液，規(guī)格250 mL/瓶，濃度0.15 g原藥材/mL，批號20160408；FZR5，20 μg/mL，美國Sigma公司，批號20160206。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、抗IP3R抗體，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號ab108517；Trizol，愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司，批號15596-026；DAPI，美國Sigma公司，批號023K1826；Rever Tra Ace?qPCR RT試劑盒，東洋紡上海生物科技有限公司，批號FSQ101；SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒，大連寶生物工程公司，批號DRR420A。7500實時PCR擴增儀（美國ABI公司），GL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業(yè)），BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾），NIS Elements F3.0軟件（日本尼康）。

1.4 造模

采用課題組前期造模方法[5]，用塑料套管和市售橡皮筋阻斷SD大鼠右后肢血流4 h，制備缺血-再灌注損傷模型。正常組大鼠不阻斷血流。

1.5 分組和給藥

將80只實驗大鼠按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、桃紅四物湯組和阻滯劑組，每組20只。桃紅四物湯組于造模前3 d開始給予桃紅四物湯藥液灌胃，2次/d，造模前2 h再給藥1次，共7次，給藥劑量根據(jù)體質(zhì)量通過體表面積-劑量換算法計算得出，依據(jù)課題組前期動物實驗結(jié)果，桃紅四物湯中劑量（0.15 g原藥材/mL）為最佳藥效濃度[2]，即每只大鼠每日給藥劑量為1 mL桃紅四物湯藥液＋3 mL蒸餾水；阻滯劑組造模前2 h腹腔注射1 mL FZR5；正常組和模型組大鼠同時點給予等體積蒸餾水灌胃。

1.6 取材

在缺血-再灌注0、2、4、8 h 4個時間點，各組隨機選取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定在自制手術(shù)臺，沿右側(cè)后肢長軸方向依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，充分暴露腓腸肌肌腹組織，切取腓腸肌100 mg，冰鹽水迅速洗凈血液，濾紙吸干水分，剪刀切割剪碎后裝入凍存管，置于-70 ℃冰箱保存。根據(jù)前期實驗結(jié)果，HE染色、細(xì)胞凋亡及免疫組化檢測只選擇缺血-再灌注損傷后肢體損傷最嚴(yán)重的時點（8 h）進(jìn)行檢測。

1.7 HE染色

取大鼠部分腓腸肌組織，4%中性甲醛溶液固定，石蠟切片（厚4 μm），HE染色，切片均進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)評價。

1.8 DAPI熒光染色

取大鼠部分腓腸肌組織，DAPI熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察腓腸肌細(xì)胞凋亡，使用Image-Pro Plus version 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每個樣品取5個視野，計算凋亡指數(shù)（細(xì)胞核濃縮細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.9 免疫組化檢測

取大鼠腓腸肌組織，多聚甲醛固定，切片，3%過氧化氫處理，并與10%山羊血清預(yù)孵育，然后與抗IP3R（1∶100）抗體4 ℃孵育，用HRP標(biāo)記的IgG孵育樣品，DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯微鏡下觀察顯色過程，使用NIS Elements F3.0軟件200倍光學(xué)顯微鏡下采集圖像，用Image Pro Plus versionv 6.0單盲法檢測陽性表達(dá)積分光密度（IOD值）。

1.10 RT-PCR檢測

采用Trizol法提取腓腸肌總RNA，取約100 mg腓腸肌組織，加入Trizol溶液，加Oligo（dT）181 μL、5×M-MLV buffer 4 μL、總RNA 2 μL、M-MLV 1 μL，補水至20 μL體系，按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（引物序列見表1），補水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：按照SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒說明進(jìn)行。采用相對定量PCR的方法，以GAPDH為內(nèi)參，測定靶基因相對表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt＝ΔCt對照組－ΔCt樣品組。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨立樣本t檢驗對建模前后數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，多重比較用方差分析，再進(jìn)行Fisher最小顯著性差異檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各基因PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常組腓腸肌纖維呈長索狀，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，肌漿豐富，每一肌纖維內(nèi)表面有多個緊密附著的細(xì)胞核，核大小、著色均勻，未見異常改變；模型組缺血-再灌注后肌纖維紊亂不規(guī)則，增厚、水腫，部分肌纖維完整，肌纖維間縫隙擴大，肌細(xì)胞破壞，明顯炎性浸潤；桃紅四物湯組和阻滯劑組肌纖維輕度破壞，細(xì)胞受損腫大，排列尚整齊，肌纖維間縫隙稍擴大，炎性浸潤不明顯，較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腓腸肌形態(tài)（HE染色，×200）

2.2 DAPI熒光染色結(jié)果

正常組細(xì)胞核呈圓形或橢圓形狀，核形完整，染色均勻；除正常組外，其余各組均可見凋亡小體，即核碎裂成大小不等的圓形小體，被細(xì)胞膜包繞，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組（P＜0.05），桃紅四物湯組、阻滯劑組細(xì)胞著色較重，核出現(xiàn)濃縮、呈新月形聚集于核膜一邊，但細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05），桃紅四物湯細(xì)胞凋亡率明顯低于阻滯劑組（P＜0.05）。見圖2、圖3。

2.3 桃紅四物湯對模型大鼠腓腸肌三磷酸肌醇受體蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腓腸肌IP3R蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠腓腸肌IP3R蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），桃紅四物湯組與阻滯劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、圖5。

2.4 桃紅四物湯對模型大鼠腓腸肌三磷酸肌醇受體mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠各時點腓腸肌IP3R mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠再灌注0、2、4、8 h腓腸肌IP3R mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），不同再灌注時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞核形態(tài)（DAPI熒光染色，×200）

圖3 各組大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，每組5只）

圖4 各組大鼠腓腸肌IP3R蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠腓腸肌IP3R蛋白陽性表達(dá)比較（±s，每組5只）

表2 各組大鼠不同時間點腓腸肌IP3R mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點腓腸肌IP3R mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 0 h 2 h 4 h 8 h 正常組 20 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13模型組 20 57.23±1.71*58.43±1.23* 62.16±0.73*59.74±1.75*桃紅四物湯組 20 40.83±0.65#44.40±1.51# 48.60±0.93#46.20±0.84#阻滯劑組 20 40.72±1.59#44.20±1.07# 48.90±1.14#46.58±1.04#

3 討論

LIRI對骨骼肌的影響是毀滅性的，生理解剖學(xué)研究表明，缺血3 h后即出現(xiàn)不可逆的肌細(xì)胞損傷，6 h時幾乎完全消失[6-7]。目前較為一致的觀點認(rèn)為，LIRI可通過能量代謝障礙、氧應(yīng)激和Ca2+超載導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡，其中Ca2+是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要第二信使[8-11]；骨骼肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+主要存在于肌漿網(wǎng)中，有IP3敏感和IP3不敏感兩類鈣池，分別由IP3R系統(tǒng)和蘭尼啶受體系統(tǒng)控制，Wnt/Ca2+通路是一種Ca2+調(diào)節(jié)信號網(wǎng)絡(luò)，該通路激活可上調(diào)IP3R的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞Ca2+超載。

研究表明，桃紅四物湯及其組方藥物在缺血-再灌注損傷性疾病中治療效果顯著。紅花提取物可通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2基因表達(dá)起到對抗缺血-再灌注損傷時細(xì)胞凋亡的作用[12]。川芎有效成分川芎嗪在多個內(nèi)臟器官的缺血-再灌注損傷中具有保護作用[13-14]。桃紅四物湯可降低肢體缺血-再灌注損傷模型大鼠血清丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性，減少氧自由基產(chǎn)生，減輕過氧化損傷[2]。桃紅四物湯可抑制腦缺血-再灌注損傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3和p53的表達(dá)，從而減輕腦細(xì)胞凋亡[15]，在腎臟缺血-再灌注損傷方面，桃紅四物湯通過抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠腎臟功能[16]。

本研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯組、阻滯劑組細(xì)胞凋亡率和熒光強度明顯低于模型組，提示阻滯劑、桃紅四物湯預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到減輕LIRI作用。RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組IP3R蛋白和mRNA表達(dá)均上調(diào)，鑒于骨骼肌IP3R的化學(xué)門控Ca2+釋放通道屬性，該受體過度激活可誘導(dǎo)Ca2+超載從而開啟細(xì)胞凋亡[17]，表明IP3R是LIRI中的關(guān)鍵蛋白；與模型組比較，阻滯劑組IP3R蛋白和mRNA表達(dá)均下調(diào)，表明IP3R是Wnt5a/Ca2+信號通路的下游分子，阻斷該通路可調(diào)節(jié)IP3R表達(dá)；與模型組比較，桃紅四物湯組IP3R蛋白和mRNA表達(dá)均下調(diào)，表明桃紅四物湯預(yù)處理后可下調(diào)IP3R的表達(dá)而減輕LIRI，鑒于桃紅四物湯組和阻滯劑組IP3R表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明桃紅四物湯可通過調(diào)控Wnt5a/Ca2+信號途徑下調(diào)IP3R的表達(dá)從而起到減輕LIRI作用，與本課題組體外實驗研究結(jié)果一致[2]。這為LIRI骨骼肌細(xì)胞損傷的分子機制和桃紅四物湯的防治作用提供了實驗證據(jù)。本研究桃紅四物湯組細(xì)胞凋亡率低于阻滯劑組，鑒于中藥多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點效應(yīng)，以及G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的復(fù)雜性，同一配體可通過不同Wnt受體途徑激活多條信號通路發(fā)揮不同效應(yīng)，不同配體也可作用于同一受體發(fā)揮相同效應(yīng)，各通路之間存在相互作用，最終形成復(fù)雜的Wnt蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，Wnt5a是眾多Wnt家族中的一員，桃紅四物湯在Wnt5a/Ca2+信號通路中的具體作用靶點及是否還有其他信號途徑介導(dǎo)LIRI，尚需今后進(jìn)一步研究。