李武平，李婕，劉宗義，易南，黃思琦，朱付平

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，常繼發(fā)于動脈損傷、動脈栓塞、擠壓綜合征、斷肢再植、帶血管蒂組織移植等疾病。目前醫(yī)學(xué)界對缺血-再灌注損傷的防治研究仍主要集中在心、肝、腦、腎等重要臟器，對LIRI缺乏特異性治療，療效不穩(wěn)定，對LIRI的分子病理機制亦尚未完全闡明。Ca2+超載及炎癥反應(yīng)是內(nèi)臟重要器官缺血-再灌注損傷的重要病理機制。前期研究表明，活血化瘀類中藥可調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白表達，減少LIRI骨骼肌細胞的凋亡[1]；同時研究發(fā)現(xiàn)，適量桃紅四物湯（含0.075、0.15 g原藥材/mL）預(yù)處理對LIRI大鼠骨骼肌具有保護作用，且呈量效關(guān)系，而濃度過高（含0.3 g原藥材/mL）不僅未出現(xiàn)理想的量效關(guān)系，反而加重骨骼肌損傷[2]；體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)損傷大鼠骨骼肌細胞，三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptor，IP3R）表達顯著上調(diào)，桃紅四物湯預(yù)處理通過調(diào)控Wnt/Ca2+信號通路中Wnt5a/IP3R途徑減輕腓腸肌成肌細胞損傷[3]，其中IP3R作為一種化學(xué)門控的Ca2+釋放通道，其過度激活是誘發(fā)Ca2+超載，導(dǎo)致細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一[4]?；诖耍狙芯恐苽浯笫驦IRI模型，以IP3R上游信號分子Wnt5a阻滯劑作為陽性對照，觀察桃紅四物湯對大鼠LIRI骨骼肌IP3R表達的影響，進一步從Wnt5a/Ca2+信號通路角度探討大鼠LIRI骨骼肌損傷機制及桃紅四物湯的干預(yù)作用，為豐富LIRI的病理機制和防治方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雄性大鼠80只，SPF級，2月齡，體質(zhì)量（230±10）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，動物使用許可證號SYXK（湘）2019-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心無病原體設(shè)施，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%，光照12 h，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物

桃紅四物湯（桃仁15 g，紅花15 g，熟地黃10 g，赤芍10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科結(jié)合現(xiàn)代工藝加工制成藥液，規(guī)格250 mL/瓶，濃度0.15 g原藥材/mL，批號20160408；FZR5，20 μg/mL，美國Sigma公司，批號20160206。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、抗IP3R抗體，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號ab108517；Trizol，愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司，批號15596-026；DAPI，美國Sigma公司，批號023K1826；Rever Tra Ace?qPCR RT試劑盒，東洋紡上海生物科技有限公司，批號FSQ101；SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒，大連寶生物工程公司，批號DRR420A。7500實時PCR擴增儀（美國ABI公司），GL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業(yè)），BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾），NIS Elements F3.0軟件（日本尼康）。

1.4 造模

采用課題組前期造模方法[5]，用塑料套管和市售橡皮筋阻斷SD大鼠右后肢血流4 h，制備缺血-再灌注損傷模型。正常組大鼠不阻斷血流。

1.5 分組和給藥

將80只實驗大鼠按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、桃紅四物湯組和阻滯劑組，每組20只。桃紅四物湯組于造模前3 d開始給予桃紅四物湯藥液灌胃，2次/d，造模前2 h再給藥1次，共7次，給藥劑量根據(jù)體質(zhì)量通過體表面積-劑量換算法計算得出，依據(jù)課題組前期動物實驗結(jié)果，桃紅四物湯中劑量（0.15 g原藥材/mL）為最佳藥效濃度[2]，即每只大鼠每日給藥劑量為1 mL桃紅四物湯藥液＋3 mL蒸餾水；阻滯劑組造模前2 h腹腔注射1 mL FZR5；正常組和模型組大鼠同時點給予等體積蒸餾水灌胃。

1.6 取材

在缺血-再灌注0、2、4、8 h 4個時間點，各組隨機選取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定在自制手術(shù)臺，沿右側(cè)后肢長軸方向依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，充分暴露腓腸肌肌腹組織，切取腓腸肌100 mg，冰鹽水迅速洗凈血液，濾紙吸干水分，剪刀切割剪碎后裝入凍存管，置于-70 ℃冰箱保存。根據(jù)前期實驗結(jié)果，HE染色、細胞凋亡及免疫組化檢測只選擇缺血-再灌注損傷后肢體損傷最嚴重的時點（8 h）進行檢測。

1.7 HE染色

取大鼠部分腓腸肌組織，4%中性甲醛溶液固定，石蠟切片（厚4 μm），HE染色，切片均進行常規(guī)組織學(xué)評價。

1.8 DAPI熒光染色

取大鼠部分腓腸肌組織，DAPI熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察腓腸肌細胞凋亡，使用Image-Pro Plus version 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析，每個樣品取5個視野，計算凋亡指數(shù)（細胞核濃縮細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%）。

1.9 免疫組化檢測

取大鼠腓腸肌組織，多聚甲醛固定，切片，3%過氧化氫處理，并與10%山羊血清預(yù)孵育，然后與抗IP3R（1∶100）抗體4 ℃孵育，用HRP標記的IgG孵育樣品，DAB進行顯色反應(yīng)，顯微鏡下觀察顯色過程，使用NIS Elements F3.0軟件200倍光學(xué)顯微鏡下采集圖像，用Image Pro Plus versionv 6.0單盲法檢測陽性表達積分光密度（IOD值）。

1.10 RT-PCR檢測

采用Trizol法提取腓腸肌總RNA，取約100 mg腓腸肌組織，加入Trizol溶液，加Oligo（dT）181 μL、5×M-MLV buffer 4 μL、總RNA 2 μL、M-MLV 1 μL，補水至20 μL體系，按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（引物序列見表1），補水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：按照SYBR?Premix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒說明進行。采用相對定量PCR的方法，以GAPDH為內(nèi)參，測定靶基因相對表達量，采用2?ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt＝ΔCt對照組－ΔCt樣品組。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨立樣本t檢驗對建模前后數(shù)據(jù)進行比較，多重比較用方差分析，再進行Fisher最小顯著性差異檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各基因PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常組腓腸肌纖維呈長索狀，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，肌漿豐富，每一肌纖維內(nèi)表面有多個緊密附著的細胞核，核大小、著色均勻，未見異常改變；模型組缺血-再灌注后肌纖維紊亂不規(guī)則，增厚、水腫，部分肌纖維完整，肌纖維間縫隙擴大，肌細胞破壞，明顯炎性浸潤；桃紅四物湯組和阻滯劑組肌纖維輕度破壞，細胞受損腫大，排列尚整齊，肌纖維間縫隙稍擴大，炎性浸潤不明顯，較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腓腸肌形態(tài)（HE染色，×200）

2.2 DAPI熒光染色結(jié)果

正常組細胞核呈圓形或橢圓形狀，核形完整，染色均勻；除正常組外，其余各組均可見凋亡小體，即核碎裂成大小不等的圓形小體，被細胞膜包繞，細胞核邊緣不規(guī)則，細胞凋亡率明顯高于正常組（P＜0.05），桃紅四物湯組、阻滯劑組細胞著色較重，核出現(xiàn)濃縮、呈新月形聚集于核膜一邊，但細胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05），桃紅四物湯細胞凋亡率明顯低于阻滯劑組（P＜0.05）。見圖2、圖3。

2.3 桃紅四物湯對模型大鼠腓腸肌三磷酸肌醇受體蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠腓腸肌IP3R蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠腓腸肌IP3R蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05），桃紅四物湯組與阻滯劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、圖5。

2.4 桃紅四物湯對模型大鼠腓腸肌三磷酸肌醇受體mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠各時點腓腸肌IP3R mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠再灌注0、2、4、8 h腓腸肌IP3R mRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05），不同再灌注時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠腓腸肌細胞核形態(tài)（DAPI熒光染色，×200）

圖3 各組大鼠腓腸肌細胞凋亡率比較（±s，每組5只）

圖4 各組大鼠腓腸肌IP3R蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠腓腸肌IP3R蛋白陽性表達比較（±s，每組5只）

表2 各組大鼠不同時間點腓腸肌IP3R mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點腓腸肌IP3R mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 0 h 2 h 4 h 8 h 正常組 20 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13 31.37±0.13模型組 20 57.23±1.71*58.43±1.23* 62.16±0.73*59.74±1.75*桃紅四物湯組 20 40.83±0.65#44.40±1.51# 48.60±0.93#46.20±0.84#阻滯劑組 20 40.72±1.59#44.20±1.07# 48.90±1.14#46.58±1.04#

3 討論

LIRI對骨骼肌的影響是毀滅性的，生理解剖學(xué)研究表明，缺血3 h后即出現(xiàn)不可逆的肌細胞損傷，6 h時幾乎完全消失[6-7]。目前較為一致的觀點認為，LIRI可通過能量代謝障礙、氧應(yīng)激和Ca2+超載導(dǎo)致骨骼肌細胞凋亡，其中Ca2+是介導(dǎo)細胞凋亡的重要第二信使[8-11]；骨骼肌細胞內(nèi)游離Ca2+主要存在于肌漿網(wǎng)中，有IP3敏感和IP3不敏感兩類鈣池，分別由IP3R系統(tǒng)和蘭尼啶受體系統(tǒng)控制，Wnt/Ca2+通路是一種Ca2+調(diào)節(jié)信號網(wǎng)絡(luò)，該通路激活可上調(diào)IP3R的表達，從而誘導(dǎo)細胞Ca2+超載。

研究表明，桃紅四物湯及其組方藥物在缺血-再灌注損傷性疾病中治療效果顯著。紅花提取物可通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2基因表達起到對抗缺血-再灌注損傷時細胞凋亡的作用[12]。川芎有效成分川芎嗪在多個內(nèi)臟器官的缺血-再灌注損傷中具有保護作用[13-14]。桃紅四物湯可降低肢體缺血-再灌注損傷模型大鼠血清丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性，減少氧自由基產(chǎn)生，減輕過氧化損傷[2]。桃紅四物湯可抑制腦缺血-再灌注損傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3和p53的表達，從而減輕腦細胞凋亡[15]，在腎臟缺血-再灌注損傷方面，桃紅四物湯通過抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠腎臟功能[16]。

本研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯組、阻滯劑組細胞凋亡率和熒光強度明顯低于模型組，提示阻滯劑、桃紅四物湯預(yù)處理可減少細胞凋亡，從而達到減輕LIRI作用。RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組IP3R蛋白和mRNA表達均上調(diào)，鑒于骨骼肌IP3R的化學(xué)門控Ca2+釋放通道屬性，該受體過度激活可誘導(dǎo)Ca2+超載從而開啟細胞凋亡[17]，表明IP3R是LIRI中的關(guān)鍵蛋白；與模型組比較，阻滯劑組IP3R蛋白和mRNA表達均下調(diào)，表明IP3R是Wnt5a/Ca2+信號通路的下游分子，阻斷該通路可調(diào)節(jié)IP3R表達；與模型組比較，桃紅四物湯組IP3R蛋白和mRNA表達均下調(diào)，表明桃紅四物湯預(yù)處理后可下調(diào)IP3R的表達而減輕LIRI，鑒于桃紅四物湯組和阻滯劑組IP3R表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明桃紅四物湯可通過調(diào)控Wnt5a/Ca2+信號途徑下調(diào)IP3R的表達從而起到減輕LIRI作用，與本課題組體外實驗研究結(jié)果一致[2]。這為LIRI骨骼肌細胞損傷的分子機制和桃紅四物湯的防治作用提供了實驗證據(jù)。本研究桃紅四物湯組細胞凋亡率低于阻滯劑組，鑒于中藥多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點效應(yīng)，以及G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的復(fù)雜性，同一配體可通過不同Wnt受體途徑激活多條信號通路發(fā)揮不同效應(yīng)，不同配體也可作用于同一受體發(fā)揮相同效應(yīng)，各通路之間存在相互作用，最終形成復(fù)雜的Wnt蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，Wnt5a是眾多Wnt家族中的一員，桃紅四物湯在Wnt5a/Ca2+信號通路中的具體作用靶點及是否還有其他信號途徑介導(dǎo)LIRI，尚需今后進一步研究。