查鑫 阮婧華 范東生 蘇松柏 夏青 辛加敏 湯謹(jǐn) 萬(wàn)明香

【摘 要】 目的：建立柴葛暢原合劑中葛根素的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6mm×250mm，5m） ， 甲醇-0.1%甲酸（30∶[KG-*3/5]70） 為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，波長(zhǎng)250nm，柱溫調(diào)整到25℃。結(jié)果：在這一條件下，葛根素和其他色譜峰分離程度達(dá)到要求，在0.0675 ～0.405g質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系達(dá)到要求（r2=0.9999），回收率102.3%，RSD為2.5% （n=6）。結(jié)論： 該操作簡(jiǎn)單、專屬程度大、靈敏特異性高、重復(fù)性強(qiáng)，可以用于該制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 柴葛暢原合劑; 葛根素;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2021）1-0034-04

Determination of Puerarin in Chaige Changyuan Mixture

CHA Xin RUAN Jinghua1* FAN Dongsheng SU Songbai XIA Qing XIN Jiamin TANG Jin WANG Mingxiang

The First Affiliated Hospital of Guiyang University of Chinese Medicine， Guiyang 550001， China

Abstract：Objective To establishan a high performance liquid chromatography （HPLC） method for determinationthe content of puerarin in Chaige Changyuan mixture. Methods The chromatographic column was CAPCELL PAK C18 （4.6mm × 250mm， 5 m）. Mobile phase methanol-0.1% formic acid （30∶[KG-*3/5]70）， flow rate 1.0mL·min-1， detection wavelength 250nm， column temperature 25℃. Results Under this condition， the separation degree of puerarin and other chromatographic peaks meets the requirements and peak area was good in 0.0675 ～ 0.405ug （R2=0.9999）， the average recovery was 102.3%， RSD2.5% （n=6）. Conclusion The operation is simple， exclusive， high sensitivity and specificity， and strong repeatability， can be used in the quality control stage of the reagent.

Keywords：Chaige Changyuan Mixture; Puerarin; High Performance Liquid Chromatography

醫(yī)院制劑“柴葛暢原合劑”由陶氏柴葛解肌湯合藿香正氣散加減化裁而成[1]，用于感冒風(fēng)寒、郁而化熱證。處方由葛根、柴胡、穿心蓮等十四味藥組成。葛根為君藥，解肌清熱、生津止渴[2];現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明葛根主要藥效成分葛根素，具有抗炎、抗氧化等多種功能活性[3-5]，為葛根制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)[6-7]。目前醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)含量檢測(cè)，難以保證該制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。本試驗(yàn)采用HPLC法建立柴葛暢原合劑中葛根素的含量測(cè)定方法，以期完善柴葛暢原合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該操作簡(jiǎn)單、專屬性高、靈敏高、重復(fù)程度強(qiáng)，能夠應(yīng)用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（waters E2695，美國(guó)waters公司），二極管陣列紫外檢測(cè)器（Waters 2998，美國(guó)waters公司）;MS105DU天平（梅特勒-托和多儀器有限公司）。

1.2 試藥 柴葛暢原合劑（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20200301、20200302和20200303）;葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-201615）;甲醇為色譜純（美國(guó)TEDIA公司）;實(shí)驗(yàn)用水是實(shí)驗(yàn)室超濾設(shè)備MILLI-Q IQ 7000的過濾水;乙醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱（250mm×4.6mm，5um），流動(dòng)相A為甲醇，B使用甲酸，其比例為30∶[KG-*3/5]70，溫度控制在25℃，流速需達(dá)到1.0mL/min，其波長(zhǎng)250nm，體積為10uL。該物質(zhì)和其他色譜峰分離程度達(dá)到需要，時(shí)間共需要12min，計(jì)算該物質(zhì)峰理論塔板數(shù)不低于4000。

2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液設(shè)置： 精準(zhǔn)稱量對(duì)照品5.4mg，采用濃度為30%乙醇進(jìn)行稀釋定容至20mL容量瓶中，最終濃度為0.27mg/mL。從上述儲(chǔ)備液中取1mL至10mL的量瓶，30%乙醇定容，得濃度 0.027mg/mL對(duì)照品溶液，4℃環(huán)境中儲(chǔ)存。

供試品溶液制作： 精準(zhǔn)吸取供試品1mL至20mL容量瓶中，30%乙醇定容，混勻，過0.22m濾膜，得供試品溶液。

陰性空白對(duì)照溶液： 按照相應(yīng)的比例以及相關(guān)的工藝制作陰性該物質(zhì)樣品，并依照相關(guān)的手段制作陰性空白對(duì)照。

2.3 專屬性試驗(yàn) 使用“2.2”中的對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液，照“2. 1”項(xiàng)下檢測(cè)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行記錄。結(jié)果表明陰性對(duì)照不影響該物質(zhì)的測(cè)定。色譜圖如圖 1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液 2.5L，5L，7.5L，10L，12.5L，15L，按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以檢測(cè)物質(zhì)的進(jìn)樣量（μg）作為橫軸（X），峰面積為縱軸（Y）制作曲線，得到方程Y=4068.4X-84688（r2=0.9999）。其數(shù)據(jù)顯示，該物質(zhì)在0.0675 ～ 0.4050g和峰面積線性關(guān)系達(dá)到預(yù)期。

2.5 精密度試驗(yàn) 使用“2.4”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下，對(duì)其進(jìn)行分析并對(duì)其數(shù)據(jù)處理，重復(fù)6次操作，峰面積進(jìn)行詳細(xì)的記錄。結(jié)果該物質(zhì)的峰面積達(dá)到RSD為0.52%（n=6），證明儀器的精密程度可以進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)202003 01），在0、2、4、8、12、24h，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下，對(duì)其進(jìn)行分析并對(duì)其數(shù)據(jù)處理，峰面積進(jìn)行詳細(xì)的記錄。結(jié)果表明，該物質(zhì)的峰面積達(dá)到RSD為1. 7% （n=6），通過這一結(jié)果可以表明溶液在1日內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同的6份樣品（ 批號(hào)20200301） ，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對(duì)其數(shù)據(jù)處理，檢測(cè)其含量。結(jié)果表明該物質(zhì)的平均含量達(dá)到0.3217mg/mL，RSD為1.9%（n=6），證實(shí)該種方式能夠進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已經(jīng)知道含量的同一批樣品（批號(hào)：20200301，樣品中葛根素含量為0.32mg/mL），精準(zhǔn)吸取規(guī)定體積樣品6份，精準(zhǔn)加入質(zhì)量為0.1601mg葛根素對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下制備相應(yīng)的供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對(duì)其數(shù)據(jù)處理，算出回收率。見表1。

2.9 樣品測(cè)定 取3批柴葛暢原合劑樣品，按“2.2”項(xiàng)下制作相應(yīng)的供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對(duì)其數(shù)據(jù)處理，分別進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算該物質(zhì)的含量。見表2。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 柴葛暢原合劑作為本院的院內(nèi)制劑之一，臨床療效良好、市場(chǎng)需求較大，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低，已不適應(yīng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化，因此本研究參照2015年版《中國(guó)藥典》第一部“葛根”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，采用HPLC色譜法來(lái)測(cè)定柴葛暢原合劑中葛根素的含量。醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑的君藥葛根中葛根素的含量測(cè)定進(jìn)行HPLC測(cè)定，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，嘗試流動(dòng)相為甲醇-水（25∶[KG-*3/5]75）[8-9]、流速為1.0mL/min等色譜條件，測(cè)定柴葛暢原合劑中葛根素的含量，其色譜峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，并沒有達(dá)到最佳分離效果。為達(dá)到最佳分離效果，相應(yīng)地調(diào)整了色譜條件，流動(dòng)相選用0.1%甲酸-甲醇（30∶[KG-*3/5]70），流速1.0mL/min，葛根素峰保留時(shí)間為12min左右，分離效果好，峰型理想。

3.2 樣品處理優(yōu)化 試驗(yàn)中曾用樣品揮干后加30%乙醇定容至20mL加熱回流半小時(shí)，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，結(jié)果顯示，其峰面積和筆者所用的樣品處理方法峰面積相差不大，考慮到其簡(jiǎn)單，好操作的特點(diǎn)，故筆者采取了“2.1”項(xiàng)下的樣品處理方法，此方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性，專屬性良好，特別適合醫(yī)院制劑室利用現(xiàn)有的設(shè)備條件進(jìn)行中藥制劑生產(chǎn)，控制質(zhì)量。

4 結(jié)論

醫(yī)院中藥制劑是指市場(chǎng)上不存在但臨床上必需且已獲準(zhǔn)生產(chǎn)的制劑類型。它們中的大多數(shù)是根據(jù)秘密秘方，處方或醫(yī)院處方開發(fā)的。常用的劑型有合劑，糖漿劑，顆粒劑和膠囊劑等，因?yàn)槠浏熜Э隙ㄇ沂芑颊呦矚g。近年來(lái)，很多新藥取締了院內(nèi)制劑，并投入了使用。除此之外，藥品監(jiān)督管理部門增加了監(jiān)督管理力度，醫(yī)院對(duì)中藥制劑的壓力也逐漸增加[10-12]。怎樣提高制劑品質(zhì)，開發(fā)可靠，放心，并且有治療效果的制劑，已成為中醫(yī)醫(yī)院發(fā)展過程中需考慮的關(guān)鍵，也是該領(lǐng)域相關(guān)人員需解決的任務(wù)[13-14]。筆者以醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑為研究對(duì)象，以葛根素做為柴葛暢原合劑中含量測(cè)定的指標(biāo)，建立了高效液相測(cè)定其葛根素含量測(cè)定的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、專屬程度大、靈敏特異性高、重復(fù)性強(qiáng)，可以在該制劑的質(zhì)量控制階段使用。

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（收稿日期：2020-07-02 編輯：陶希睿）