王貴一，于雅靜，何貴萍,3，張佳琪,3，余佳熹，呂遠(yuǎn)平,*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.四川大學(xué) 健康食品科學(xué)評(píng)價(jià)體系研究中心， 成都 610065；3.四川大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065)

玫瑰(RosarugosaThunb.)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)多年生常綠或落葉灌木[1]。玫瑰花中含有豐富的多酚類、多糖類和小分子活性物質(zhì)。玫瑰花色鮮艷，富含類黃酮類化合物，主要為花色素(anthocyanidins)和黃酮醇類物質(zhì)[2]。花色素作為天然色素，其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及對(duì)人體有益的功能性活性成分，具有消炎、抗氧化等作用[3]，天然色素著色均勻，色澤鮮艷，亮度好，常作為安全的著色劑被用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)[4-5]。

花色苷(anthocyanin)是由一分子花青素(anthocyanidin)配基與一個(gè)或多個(gè)糖基通過(guò)糖苷鍵結(jié)合形成的配糖體，屬于類黃酮化合物，具有基本的C6-C3-C6碳骨架結(jié)構(gòu)[6-7]。通常在低pH范圍內(nèi)(pH<3)，花色苷以明亮紅色的黃烊鹽陽(yáng)離子形式存在，隨著pH升高至4～6，水解成無(wú)色的半縮醛形式，或者去質(zhì)子化變成藍(lán)色的醌型堿，pH在接近7時(shí)，C環(huán)開(kāi)始打開(kāi)出現(xiàn)黃色的查爾酮形式[8]?；ㄉ站哂锌寡趸?、抗炎、抗腫瘤等生物活性和保健功能，具有較高的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。

花色苷分子中含有大量酚羥基和甲氧基等取代基，化學(xué)性質(zhì)活潑，在加工過(guò)程中穩(wěn)定性較差，花色苷的顏色和生物活性易受金屬離子等因素的影響[10]。通常，將體系pH值調(diào)到3及以下，這樣的酸性環(huán)境有利于花色苷向黃烊鹽陽(yáng)離子形式轉(zhuǎn)變，賦予更好的穩(wěn)定性[11]。本研究采用CIELAB色空間及花色苷保存率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究金屬離子對(duì)玫瑰花色苷水提液穩(wěn)定性的影響，為玫瑰花色苷的開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玫瑰花瓣(中華1號(hào))：四川千領(lǐng)農(nóng)業(yè)科技有限公司；氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、乙酸鉛、氯化鈣、氯化鋅、氯化錳、氯化鋁、氯化銅、氯化鐵：均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CM-5型分光測(cè)色計(jì) 柯尼卡美能達(dá)株式會(huì)社；UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；ESJ210-4A型電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；ST2100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；XK96-A型快速混勻器 江蘇新康醫(yī)療有限公司；Milli-Q Direct型水純化系統(tǒng) 默克密理博公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰花色苷提取工藝流程

玫瑰花粉末(過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩)→超聲輔助溶劑浸提(55 ℃，2 h)→抽濾→玫瑰花色苷水提液。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取2.0 g玫瑰花粉末，加入100 mL pH值為3.0的超純水，在55 ℃水浴鍋中浸提2 h，抽濾得到玫瑰花色苷超純水提液，備用。根據(jù)GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[12]對(duì)水中常見(jiàn)金屬離子限量的不同，分別配制不同濃度梯度的NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、ZnCl2、CuCl2、MnCl2、AlCl3、FeCl3、(CH3COO)2Pb溶液，分別加入超純水配制的玫瑰花色苷水提液中，模擬生活用水，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[13]。各金屬離子的最大濃度分別為NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl(100 mmol/L)、ZnCl2、CuCl2(20 mmol/L)、MnCl2(2 mmol/L)、AlCl3、FeCl3(10 mmol/L)、(CH3COO)2Pb (0.05 mmol/L)。加入金屬離子的玫瑰花色苷水提液在室溫下避光保存，測(cè)定顏色的動(dòng)態(tài)變化并計(jì)算花色苷的保存率，分析各金屬離子對(duì)玫瑰花色苷水提液穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 CIELAB色空間及測(cè)定方法

CIELAB色空間，即L*、a*、b*色空間，是目前常用的表征物體顏色的方法之一，其組成見(jiàn)圖1。

圖1 CIELAB均勻顏色空間Fig.1 CIELAB uniform color space

其中，L*值、a*值和b*值分別表示亮度和色度坐標(biāo)；a*值和b*值分別表示紅綠軸和藍(lán)黃軸上顏色的飽和度；色差△E*表示顏色變化的程度，由以下公式計(jì)算確定：

△E*值越大，越容易被肉眼識(shí)別，規(guī)定△E*>3.5時(shí)，肉眼能觀察到色澤的變化[14]。

1.3.4 玫瑰花色苷顏色變化的測(cè)定

選擇CM-5分光測(cè)色計(jì)的液體測(cè)量模式，將待測(cè)花色苷樣液注入厚2 mm的石英比色皿(CM-A97)至刻度線以上，采用標(biāo)準(zhǔn)光源D65，以超純水為空白校準(zhǔn)，在25 ℃恒溫下測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次[15]。將水提液的pH值調(diào)至3.0，在室溫下避光保存，以提取液制備0 h的初始L*、a*、b*值為標(biāo)準(zhǔn)顏色，150 h內(nèi)測(cè)定各樣品溶液L*、a*、b*值的動(dòng)態(tài)變化，計(jì)算△E*值，分析其顏色變化。

1.3.5 玫瑰花色苷保存率的計(jì)算

玫瑰色素中主要的呈色物質(zhì)為花色苷，其存在高度分子共軛體系，具有酸性和堿性基團(tuán)，玫瑰花色苷溶液在200～400 nm之間有較多吸收峰，在可見(jiàn)光區(qū)有518 nm一個(gè)較大吸收峰，選取518 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[16]。分別在518 nm下測(cè)定初始花色苷水提液的吸光度A0及存放150 h后水提液的吸光度A1，以超純水為空白對(duì)照組。按照以下公式計(jì)算花色苷保存率：

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花色苷超純水提液的穩(wěn)定性

在518 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，測(cè)得超純水提取的花色苷水提液A0為0.6491 nm，經(jīng)150 h存放后，其水提液吸光度A1為0.4855 nm，根據(jù)計(jì)算可得，超純水提取液的保存率為74.8%。

2.2 Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷水提液放置過(guò)程中顏色穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2，放置150 h后的保存率見(jiàn)表1。

表1 Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷保存率的影響Table 1 Effect of Na+，Mg2+，K+，Pb2+ on the retention rates of rose anthocyanins

圖2 Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷水提液顏色穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of Na+，Mg2+，K+，Pb2+ on color stability of aqueous solution of rose anthocyanins

生活飲用水中Na+、Mg2+、K+的濃度低于100 mmol/L，Pb2+的濃度低于0.05 mmol/L。由圖2可知，4種不同濃度的金屬離子的△E*值隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增大，但最終都趨于較穩(wěn)定。150 h后，△E*數(shù)值均小于3.5，表明無(wú)肉眼可見(jiàn)的顏色變化。

由表1可知，同一種金屬離子，隨著濃度的增加，其保存率均下降。加入Na+、Mg2+、K+、Pb2+4種金屬離子的花色苷水提液在常溫下放置150 h后，其花色苷均有所損耗，但150 h后，最終花色苷保存率與超純水提取液的保存率相近。說(shuō)明自來(lái)水中含有的Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷的穩(wěn)定性幾乎無(wú)影響。

2.3 Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+對(duì)玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+4種金屬離子對(duì)玫瑰花色苷水提液放置過(guò)程中顏色穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3，放置150 h后的保存率見(jiàn)表2。

表2 Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+對(duì)玫瑰花色苷保存率的影響Table 2 Effect of Ca2+，Zn2+，Mn2+，Al3+ on the retention rates of rose anthocyanins

圖3 Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+對(duì)玫瑰花色苷水提液顏色穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of Ca2+，Zn2+，Mn2+，Al3+ on color stability of aqueous solution of rose anthocyanins

由圖3可知，在20 h內(nèi)，各濃度的Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+的玫瑰花色苷水提液的△E*值隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而增大。20 h后，Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+的玫瑰花色苷水提液的△E*值都出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)，但值均小于3.5，即肉眼不能察覺(jué)到顏色變化。

由表2可知，在常溫下放置150 h后，這4種金屬離子均能提高花色苷水提液的花色苷保存率。對(duì)于同一種金屬離子，保存率隨離子濃度增大而增大。一般來(lái)說(shuō)，花色苷分子中羥基數(shù)目多則穩(wěn)定性較弱，發(fā)生甲基化、糖基化和?；磻?yīng)可以提高穩(wěn)定性?？赡苁沁@幾種金屬離子與花色苷分子中相鄰的酚羥基螯合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，對(duì)花色苷結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用[17-18]。說(shuō)明自來(lái)水中含有少量的Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+對(duì)玫瑰花色苷的顏色穩(wěn)定性無(wú)明顯影響，離子濃度達(dá)到一定值時(shí)能提高花色苷的保存率。

2.4 Cu2+對(duì)玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

Cu2+對(duì)玫瑰花色苷水提液放置過(guò)程中顏色穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖4，添加Cu2+的水提液放置150 h后的花色苷保存率見(jiàn)表3。

圖4 Cu2+對(duì)玫瑰花色苷水提液顏色穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of Cu2+ on color stability of aqueous solution of rose anthocyanins

表3 Cu2+對(duì)玫瑰花色苷保存率的影響Table 3 Effect of Cu2+on the retention rates of rose anthocyanins

由圖4可知，水中Cu2+濃度在10 mmol/L以內(nèi)時(shí)，玫瑰花色苷水提液的△E*值均不會(huì)超過(guò)3.5，即水提液的顏色不會(huì)發(fā)生肉眼可見(jiàn)的變化，但a*值和b*值都有小幅度減?。划?dāng)水中Cu2+濃度在10～20 mmol/L時(shí)，放置20 h后△E*值超過(guò)3.5，此后在3.5～4.0范圍內(nèi)波動(dòng)并逐漸趨于穩(wěn)定，a*值和b*值減小的幅度比低濃度時(shí)大，表現(xiàn)為紅色減小和藍(lán)色增加；Cu2+濃度在5～20 mmol/L范圍內(nèi)，隨著Cu2+濃度的增大，玫瑰花色苷保存率有所降低，但仍高于不含金屬離子的超純水對(duì)照組。Cu2+濃度在5 mmol/L時(shí)，其保存率高達(dá)90.93%，即水提液中Cu2+濃度越大，保存率越低。由于本實(shí)驗(yàn)中加入的Cu2+溶液濃度很低，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Cu2+限量為1.0 mg/L，因此認(rèn)為Cu2+本身的顏色不會(huì)對(duì)水提液的顏色產(chǎn)生影響。

玫瑰花色苷水提液中含有的Cu2+濃度大于10 mmol/L時(shí)，產(chǎn)生褪色現(xiàn)象，色澤隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變化。對(duì)放置150 h的添加20 mmol/L Cu2+的玫瑰花色苷水提液進(jìn)行光譜掃描，其最大吸收波長(zhǎng)從518 nm紅移至524 nm處，說(shuō)明Cu2+與花色苷發(fā)生了一定的反應(yīng)。其中一種原因可能是花色苷分子上的酚羥基、甲氧基等取代基具有孤對(duì)電子，而Cu2+作為過(guò)渡元素陽(yáng)離子，能夠提供空軌道，與花色苷絡(luò)合形成藍(lán)色的銅-花色苷絡(luò)合物[19]，表現(xiàn)為水提液紅色減小和藍(lán)色增加，特征吸收峰改變，另一種原因可能是Cu2+具有催化作用，能夠催化花色苷分子上的酚羥基氧化，從而改變了花色苷水提液的顏色，此分析與周兆祥等對(duì)梔子花黃色素與金屬離子效應(yīng)的研究結(jié)果一致[20]。由于花色苷結(jié)構(gòu)中酚羥基越多越不穩(wěn)定，Cu2+催化氧化能一定程度上提高其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[21]，造成水提液褪色和花色苷保存率比空白組高的現(xiàn)象。

綜上所述，玫瑰花色苷作為食品原料加工時(shí)，應(yīng)盡量避免與銅質(zhì)器具接觸，加工用水中的Cu2+濃度應(yīng)低于10 mmol/L，此時(shí)玫瑰花色苷的穩(wěn)定性較好。

2.5 Fe3+對(duì)玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

Fe3+對(duì)玫瑰花色苷水提液放置過(guò)程中顏色穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5，添加Fe3+的水提液放置150 h后的花色苷保存率見(jiàn)表4。

表4 Fe3+對(duì)玫瑰花色苷保存率的影響Table 4 Effect of Fe3+on the preservation rates of rose anthocyanins

圖5 Fe3+對(duì)玫瑰花色苷水提液顏色穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of Fe3+on color stability of aqueous solution of rose anthocyanins

由圖5可知，水中Fe3+濃度在2.5～10 mmol/L時(shí)，a*、b*、△E*值隨著Fe3+添加量的增加而迅速發(fā)生改變，△E*值隨著放置時(shí)間的增加逐漸升高，20 h后逐漸趨于穩(wěn)定。10 mmol/L的Fe3+可使花色苷水提液的△E*值達(dá)到10以上，肉眼可觀察到明顯的褪色現(xiàn)象。水提液的△E*值變化主要是a*值和b*值共同決定的，a*值減小(紅色減退)，b*值增大(藍(lán)色減退)，兩者的變化趨勢(shì)都與△E*值相同。

由表4可知，玫瑰花色苷水提液中加入Fe3+并放置150 h后，玫瑰花色苷的保存率下降，并隨著Fe3+濃度的增大，保存率降低。即使Fe3+濃度僅為2.5 mmol/L，花色苷保存率也僅有53.59%。根據(jù)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)e3+限量為0.3 mg/L。

玫瑰花色苷水提液中含有的Fe3+濃度高于2.5 mmol/L時(shí)，會(huì)產(chǎn)生明顯的褪色現(xiàn)象，并且花色苷的保存率顯著降低，說(shuō)明高濃度的Fe3+可削弱花色苷的穩(wěn)定性。對(duì)放置150 h的添加2.5 mmol/L Fe3+的玫瑰花色苷水提液進(jìn)行光譜掃描，其原本的最大吸收波長(zhǎng)(518 nm)已經(jīng)完全消失，波峰移動(dòng)至紫外區(qū)，說(shuō)明花色苷的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被Fe3+完全破壞或已經(jīng)生成其他物質(zhì)。造成這一現(xiàn)象的原因可能是Fe3+具有較強(qiáng)的氧化作用，能迅速氧化破壞花色苷分子中的酚羥基；也可能是因?yàn)榛ㄉ盏泥徫涣u基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易與Fe3+等金屬離子配合形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物的穩(wěn)定性強(qiáng)于花色苷，因此生成后不可逆轉(zhuǎn)[22-23]。李穎暢等研究發(fā)現(xiàn)Fe3+使藍(lán)莓花色苷溶液產(chǎn)生沉淀，顏色由紅色變?yōu)辄S褐色，花色苷保留率降低；馬越[24]試驗(yàn)證明向紫玉米花色苷的溶液中加入Fe3+，溶液迅速變成黃褐色，并產(chǎn)生黑褐色沉淀，可能是因?yàn)槎喾宇惿嘏cFe3+反應(yīng)生成復(fù)雜絡(luò)合物。

Fe3+對(duì)花青素具有破壞作用，使花青素的穩(wěn)定性下降[25]，在此實(shí)驗(yàn)中，較低濃度的Fe3+即可破壞玫瑰花色苷，降低其保存率，使顏色發(fā)生明顯改變。食品生產(chǎn)中應(yīng)注意避免鐵質(zhì)用具與玫瑰花色苷接觸，加工用水中也應(yīng)盡量除去Fe3+。

3 結(jié)論

根據(jù)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)常見(jiàn)金屬離子限量的不同，在pH值為3.0的溶液中，Na+、Mg2+、K+、Pb2+對(duì)玫瑰花色苷的顏色穩(wěn)定性無(wú)明顯影響；Ca2+、Zn2+、Mn2+、Al3+4種離子不會(huì)使花色苷水提液顏色發(fā)生明顯改變，花色苷保存率有所提高，可能是由于花色苷分子中相鄰酚羥基與這4種金屬離子螯合，形成穩(wěn)定絡(luò)合物，從而對(duì)花色苷結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用。Cu2+可能通過(guò)催化花色苷分子上的酚羥基氧化等，導(dǎo)致水提液顏色產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的變化；較低濃度的Fe3+即可使花色苷水提液明顯褪色，花色苷保存率也大幅降低，可能是Fe3+的強(qiáng)氧化作用破壞花色苷分子中的酚羥基，從而使玫瑰花色苷的顏色和結(jié)構(gòu)都發(fā)生改變。所以玫瑰花色苷作為天然色素使用時(shí)，應(yīng)避免與銅、鐵質(zhì)器具接觸。本研究對(duì)玫瑰天然色素的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有一定的實(shí)用意義。

花色苷類天然色素在食品中的穩(wěn)定性應(yīng)用研究仍然是今后花色苷研究的重點(diǎn)方向，使用花色苷作為著色劑時(shí)，應(yīng)考慮到花色苷產(chǎn)品本身的純度、結(jié)構(gòu)等的不同，還需考慮與其密切相關(guān)的應(yīng)用環(huán)境條件。