郭愛(ài)鑫，楊麗雅，周曉光，何佳璘，郭一鳴，王慧萍*，宋黎明*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京 100020)

前列腺癌(prostate cancer)是男性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率高居第2位，僅次于肺癌[1-2]。近20年來(lái)隨著人口老齡化及生活條件的改善，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也逐年增加[3]。前列腺癌確診時(shí)多為晚期[4]，臨床應(yīng)用去勢(shì)療法后易產(chǎn)生耐藥而轉(zhuǎn)化為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)，患者的生存期大大縮短[5]。有證據(jù)表明缺氧是許多實(shí)體腫瘤微環(huán)境改變的主要特征，腫瘤局部缺氧是造成其轉(zhuǎn)移的重要因素之一[6-9]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)缺氧微環(huán)境對(duì)人源雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC3和人源雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲變化的影響，以期深入了解缺氧微環(huán)境對(duì)前列腺癌惡性生長(zhǎng)作用的相關(guān)機(jī)制，為臨床診療及相關(guān)研究提供思路。

材料與方法

一、研究材料

1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源：人源雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC3(編號(hào)：3111C0001CCC000115)和人源雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP(編號(hào)：3111C0001CCC000040)均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)、凍存。

2.主要試劑：兔抗人E鈣粘蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(3195T)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(5741T)購(gòu)自美國(guó)CST公司，E-cadherin、Vimentin正反引物購(gòu)自華大基因，BCA蛋白濃度試劑盒、凝膠試劑盒及結(jié)晶紫染色液購(gòu)自北京索萊寶公司，cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑購(gòu)自天根公司，Transwell小室和Matrigal基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)康寧公司，Trizol裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：兩種前列腺癌細(xì)胞分別進(jìn)行常氧和缺氧培養(yǎng)，常氧組放置于普通培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為21%O2、5%CO2和74%N2。缺氧組細(xì)胞放置于缺氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為1%O2、5%CO2和94%N2。常氧組和缺氧組細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)需要選擇不同時(shí)間培養(yǎng)后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(6～8×103個(gè)/100 μl)均勻接種入96孔板中。將常氧組和缺氧組細(xì)胞放于不同培養(yǎng)箱分別孵育不同時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24、48、72 h)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。孵育不同時(shí)間后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)分別在常、缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(PC3細(xì)胞繼續(xù)孵育4 h，LNCaP細(xì)胞繼續(xù)孵育1 h)。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A值)，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖情況。相對(duì)細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)細(xì)胞加入0.25%胰酶消化后，2 000g離心得細(xì)胞沉淀(1.5×106個(gè))，加入1 ml Trizol提取總RNA，使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。E-cadherin 引物(5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，5′-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3′)、Vimentin引物(5′-AATGACCGCTTCGCCAAC-3′，5′-CCGCATCTCCTCCTCGTAG-3′)和內(nèi)參蛋白β-actin引物(5′-TGTGATGGTGGGAATGGGTCA-3′，5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′)。使用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green)進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，按照說(shuō)明書配置20 μl體系，上機(jī)設(shè)備ABI 7500，40個(gè)循環(huán)后采用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

4.蛋白印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)：同方法3中獲得細(xì)胞沉淀，利用100 μl含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后分裝、-70℃保存。取上述提取液(含蛋白約30 μg)進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳(電泳條件為70 V 20 min，110 V 1 h)。將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉30 min、TBST洗脫后分別加入封閉液稀釋的E-cadherin兔抗人抗體(1∶1 000稀釋)、Vimentin兔抗人抗體(1∶1 000)及β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG或HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后洗膜。膜抗原-抗體復(fù)合物用ECL法染色顯示，GE Healthcare凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：根據(jù)前面的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)情況，PC3細(xì)胞分別缺氧培養(yǎng)0、8和24 h，LNCaP細(xì)胞分別缺氧培養(yǎng)0、24和48 h觀察腫瘤細(xì)胞的遷移能力變化。收集各組細(xì)胞以3×105/孔接種至6孔板。細(xì)胞匯合度接近100%時(shí)，用200 μl槍頭在6孔板內(nèi)畫橫豎兩條直線，寬度保持一致，PBS洗3次，清除漂浮細(xì)胞，加入無(wú)血清或含5%血清的培養(yǎng)基，放入缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于40倍倒置顯微鏡下觀察，并分別于一定時(shí)間后在同一部位拍照。計(jì)算劃痕愈合率即遷移率，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.Transwell實(shí)驗(yàn)：預(yù)先用無(wú)血清RMPI-1640培養(yǎng)基將50 mg/L的人工基底膜(Matrigel)1∶10稀釋后，包被Transwell小室底部膜，37℃風(fēng)干過(guò)夜，水化基底膜，于37℃放置2 h后置于24孔板中。將各組細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，將含1×105細(xì)胞的200 μl懸液加入上室，下室加入750 μl含10% FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放入37℃、5%CO2、1%O2、94%N2飽和濕度環(huán)境的溫育箱中培養(yǎng)，分別在24和48 h后取出小室，吸棄上室培養(yǎng)基，用棉簽輕拭去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次，于100倍倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。培養(yǎng)24和48 h后計(jì)數(shù)下室和上室細(xì)胞數(shù)，計(jì)算侵襲率[下室細(xì)胞數(shù)/(上室細(xì)胞數(shù)+下室細(xì)胞數(shù))×100%]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)后PC3和LNCaP細(xì)胞的增殖情況

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，本實(shí)驗(yàn)用同一時(shí)間點(diǎn)缺氧與常氧的相對(duì)增殖率與0 h時(shí)兩組的相對(duì)增殖率比較來(lái)表示每一時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與其他時(shí)間點(diǎn)比較，PC3細(xì)胞在缺氧4 h時(shí)增殖活性最高(P<0.05)，為0 h時(shí)的2.95倍；4 h后增殖活性開始下降，20 h降至最低，為0 h組的0.96倍(P<0.05)；20 h后增殖活性又開始上升，48 h細(xì)胞增殖活性是0 h的1.95倍(圖1A)。

LNCaP細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)0～16 h時(shí)間段增殖活性逐漸升高，16 h時(shí)達(dá)最高，為0 h時(shí)的4.76倍(P<0.05)；16 h后增殖活性降低，48 h和72 h分別為0 h時(shí)的0.97和0.84倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

注：與其他組比較，*P<0.05圖1 PC3與LNCaP細(xì)胞在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性變化

二、不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)后PC3和LNCaP細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)變化

采用RQ表示mRNA 相對(duì)表達(dá)量(RQ=2-△△Ct)。PCR結(jié)果顯示，在PC3細(xì)胞中，缺氧8 h時(shí)E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著高于0 h時(shí)的表達(dá)水平(RQ=1.38，P<0.05)，然后表達(dá)呈降低趨勢(shì)，在48 h時(shí)表達(dá)最低(RQ=0.21，P<0.05)(圖2A)。對(duì)LNCaP細(xì)胞而言，不同時(shí)間的缺氧培養(yǎng)E-cadherin的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，在72 h時(shí)E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)量最低(RQ=0.31，P<0.05)(圖2B)。

Vimentin的mRNA表達(dá)情況與E-cadherin不同。PC3細(xì)胞中，Vimentin的mRNA表達(dá)隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.05)，并在72 h時(shí)達(dá)到最高(RQ=2.31，P<0.05)(圖3A)。LNCaP細(xì)胞中，Vimentin的mRNA表達(dá)同樣隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.01)，在48 h時(shí)達(dá)到最高(RQ=58，P<0.01)，72 h時(shí)表達(dá)量則出現(xiàn)了下降(RQ=42，P<0.05)(圖3B)。

注：與0 h組比較，*P<0.05；與其他組比較，**P<0.01，#P<0.05；RQ=2-△△Ct圖2 PC3與LNCaP細(xì)胞在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin的mRNA表達(dá)水平變化

三、不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)后前列腺癌PC3和LNCaP細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白水平表達(dá)變化

由于PC3細(xì)胞E-cadherin的mRNA水平在48 h內(nèi)變化差異較大(圖2A)，因此檢測(cè)其蛋白水平時(shí)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)增加4 h、12 h、16 h時(shí)間點(diǎn)以便更清晰觀察。采用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參歸一化后的相對(duì)值RW來(lái)表示蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞系在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著低于0 h時(shí)的蛋白水平(P<0.01)。其中PC3細(xì)胞在48 h時(shí)蛋白表達(dá)最低(RW=0.43，P<0.05)(圖4A)；而LNCaP細(xì)胞在72 h時(shí)表達(dá)最低(RW=0.37，P<0.05)(圖4B)。

檢測(cè)Vimentin的蛋白表達(dá)水平顯示，PC3細(xì)胞的各缺氧時(shí)間點(diǎn)(4 h除外)及LNCaP細(xì)胞的各缺氧時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平均顯著高于0 h組(P<0.01)，PC3細(xì)胞在48 h時(shí)表達(dá)最高(RW=2.64，P<0.05)(圖5A)，LNCaP細(xì)胞在72 h時(shí)表達(dá)最高(RW=5.63，P<0.05)(圖5B)。

注：與其他組比較，**P<0.01，*P<0.05；RW是目標(biāo)分子與內(nèi)參歸一化后的相對(duì)值圖5 PC3與LNCaP細(xì)胞在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)Vimentin的蛋白表達(dá)情況

四、前列腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)后的細(xì)胞遷移率變化

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC3細(xì)胞缺氧8 h時(shí)，其劃痕面積顯著小于常氧組，遷移率顯著上升[(30.14±1.26)% vs.(18.26±0.84)%](P<0.01)；缺氧24 h時(shí)，劃痕面積進(jìn)一步縮小，且同樣小于常氧組，遷移率顯著上升[(47.65±1.56)% vs.(32.49±2.46)%](P<0.01)(圖6)。

LNCaP細(xì)胞缺氧24 h時(shí)，其劃痕面積也顯著小于常氧組，遷移率顯著上升[(32.92±1.94)% vs.(19.18±0.55)%](P<0.01)；缺氧48 h時(shí)，劃痕面積同樣進(jìn)一步縮小，且小于常氧組，遷移率顯著上升[(56.14±0.72)% vs.(45.12±2.01)%](P<0.01)；因LNCaP細(xì)胞缺氧培養(yǎng)8 h組遷移率與對(duì)照組無(wú)顯著差別，因此延長(zhǎng)了觀察時(shí)間即增加48 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)(圖7)。

注：與同時(shí)間點(diǎn)的常氧組比較，**P<0.01圖6 前列腺癌PC3細(xì)胞不同缺氧時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移情況

注：與同時(shí)間點(diǎn)的常氧組比較，**P<0.0圖7 前列腺癌LNCaP細(xì)胞不同缺氧時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞遷移情況

五、前列腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)后的細(xì)胞侵襲情況

根據(jù)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)作圖統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，PC3細(xì)胞缺氧8 h時(shí)[(14 835.25±271.84)vs.(10 868.18±344.31)個(gè)]和24 h時(shí)[(23 848.06±664.43)vs.(19 091.34±521.32)個(gè)]穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量均顯著多于常氧組，侵襲能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)(圖8)。

A：細(xì)胞結(jié)晶紫染色，×200；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖：與同時(shí)間點(diǎn)的常氧組比較，**P<0.01圖8 前列腺癌PC3細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LNCaP細(xì)胞缺氧24 h時(shí)[(11 852.19±453.71)vs.(7 697.48±158.32)]和48 h時(shí)[(24 187.26±529.84)vs.(18 432.37±234.46)]穿過(guò)基底膜細(xì)胞數(shù)量也均顯著多于常氧組(P<0.01)，侵襲能力顯著增強(qiáng)；與劃痕實(shí)驗(yàn)相同，LNCaP細(xì)胞延長(zhǎng)觀察時(shí)間，增加48 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)(圖9)。

A：細(xì)胞結(jié)晶紫染色，×200；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖：與同時(shí)間點(diǎn)的常氧組比較，**P<0.01，***P<0.001圖9 前列腺癌LNCaP細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)2018年全球有近130萬(wàn)前列腺癌新發(fā)病例和35.9萬(wàn)死亡病例，占男性惡性腫瘤發(fā)病率的13.5%；占男性惡性腫瘤死亡率的6.7%，高居第5位。目前臨床常用的去勢(shì)療法總有效率為70%～80%，但治療18～24個(gè)月后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)化為CRPC，CRPC患者的中位生存期只有1～2年。

前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、涉及多基因改變的復(fù)雜過(guò)程，即由正常上皮轉(zhuǎn)化為上皮過(guò)度增生，增生發(fā)生變異并演進(jìn)至癌及侵潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[10]。有研究表明，前列腺癌的生物學(xué)行為如增殖分裂、侵襲及轉(zhuǎn)移等，除了與遺傳易感性相關(guān)外，還依賴于特定的細(xì)胞因子及其相關(guān)的微環(huán)境，其中缺氧微環(huán)境引起了更多關(guān)注[6-7]。在腫瘤組織中，因?yàn)榧?xì)胞快速且無(wú)限制的增殖分裂，會(huì)出現(xiàn)局部組織缺氧，適應(yīng)缺氧并存活下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)而繼續(xù)增殖、遷移侵襲和浸潤(rùn)到其他細(xì)胞，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展。迄今為止，缺氧對(duì)晚期前列腺癌惡性生長(zhǎng)的影響機(jī)理尚未明確，但缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1，HIF-1α)在其中扮演著重要的角色[6-7]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)常氧狀態(tài)下晚期前列腺癌的惡性生長(zhǎng)依賴于新生血管生成和PI3K/AKT信號(hào)通路[11-12]，而上述效應(yīng)和通路與HIF-1α密切相關(guān)，因此我們推測(cè)缺氧可能促進(jìn)晚期前列腺癌的惡性增殖與遷移。本實(shí)驗(yàn)主要觀察體外前列腺癌細(xì)胞在不同缺氧時(shí)間導(dǎo)致的低氧微環(huán)境下所發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步闡明低氧與晚期腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。

去勢(shì)治療對(duì)早期雄激素依賴性的前列腺癌細(xì)胞起到了良好效果，但轉(zhuǎn)化成CRPC后，腫瘤細(xì)胞在缺乏雄激素的狀態(tài)下依舊能很好地生長(zhǎng)[13-14]。因此，本文選用雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC3來(lái)觀察其惡性生長(zhǎng)的特性。

從細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可以看出兩種前列腺癌細(xì)胞增殖活性隨著缺氧時(shí)間的增加不斷反復(fù)變化。在缺氧0～20 h時(shí)腫瘤細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，但期間也有升高和降低的波動(dòng)，提示缺氧時(shí)前列腺癌細(xì)胞的增殖是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。推測(cè)缺氧初期，細(xì)胞密度急劇上升發(fā)生接觸抑制，細(xì)胞的增殖速率有所下降，相關(guān)基因級(jí)聯(lián)調(diào)控使前列腺癌細(xì)胞對(duì)缺氧做出應(yīng)激反應(yīng)，癌細(xì)胞增殖能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，細(xì)胞密度下降。細(xì)胞增殖曲線同樣提示一定程度的缺氧可代償性增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，但隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)反而起到抑制的作用(LNCaP細(xì)胞在缺氧48和72 h時(shí)存活率顯著低于常氧組)，確切機(jī)理尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

缺氧微環(huán)境會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究通過(guò)細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在不同缺氧時(shí)間下兩種前列腺癌細(xì)胞的遷移速率加快、穿透基底膜數(shù)量增加，證實(shí)缺氧促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但同等條件(起始細(xì)胞量相同和缺氧時(shí)間24 h時(shí))下PC3細(xì)胞遷移侵襲速率大于LNCaP細(xì)胞，表明PC3細(xì)胞惡性程度要高于LNCaP細(xì)胞。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)LNCaP細(xì)胞之間更具有粘附性，常多個(gè)細(xì)胞粘連成團(tuán)導(dǎo)致細(xì)胞不易移動(dòng)，轉(zhuǎn)移和侵襲能力較弱。而雄激素非依賴性前列腺癌PC3細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)為典型的長(zhǎng)梭形，細(xì)胞獨(dú)立生長(zhǎng)不發(fā)生粘連，這種形態(tài)學(xué)特點(diǎn)使其更具侵襲性。從細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)也可以看出LNCaP細(xì)胞遷移速度緩慢，貼壁不牢固，侵襲能力較弱，因此適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間到48 h作為觀察點(diǎn)。PC3細(xì)胞在同等條件下遷移速率快，侵襲能力強(qiáng)而對(duì)人體更具有威脅性，也提示CRPC是臨床上治療的難點(diǎn)和研究重點(diǎn)。

很多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞包括前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移總是伴隨上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchyme transformation，EMT)的轉(zhuǎn)變[15-16]，其主要的特征有細(xì)胞黏附分子(如E-cadherin)表達(dá)的減少、角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為以Vimentin為主的細(xì)胞骨架，從而獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性。E-cadherin是典型的上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，可介導(dǎo)細(xì)胞之間互相粘附，調(diào)節(jié)正常細(xì)胞間連結(jié)的形成和維護(hù)[17-18]。Vimentin對(duì)于維持正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和上皮到間質(zhì)過(guò)渡非常重要，有助于轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的侵入性表型轉(zhuǎn)化[19-20]。在EMT過(guò)程中，癌細(xì)胞脫去上皮細(xì)胞的某些特性，如細(xì)胞間的黏附性、細(xì)胞極性，發(fā)生細(xì)胞骨架改變，向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變并獲得高度的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性。由于CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧對(duì)細(xì)胞的增殖是一個(gè)隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此，我們觀察了不同缺氧時(shí)間處理下前列腺癌細(xì)胞這兩個(gè)重要分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平以判斷是否發(fā)生EMT以及EMT過(guò)程是否也隨缺氧時(shí)間變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平隨著缺氧時(shí)間的增加兩種前列腺癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)量均逐漸減少(P<0.05)，而Vimentin表達(dá)量逐漸增多(P<0.05)，表明缺氧狀態(tài)下前列腺癌細(xì)胞發(fā)生典型的EMT。但這種轉(zhuǎn)化是實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化的，提示缺氧下的EMT轉(zhuǎn)化可能是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，具體機(jī)理需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本文通過(guò)模擬體內(nèi)缺氧微環(huán)境觀察缺氧對(duì)前列腺癌兩種細(xì)胞系惡性生長(zhǎng)的影響，表明一定程度的缺氧不僅能夠增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且能夠誘導(dǎo)EMT發(fā)生；同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。缺氧總體上有促進(jìn)前列腺癌惡性生長(zhǎng)的趨勢(shì)，但在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)也會(huì)出現(xiàn)抑制的情況，說(shuō)明即使E-cadherin等分子在晚期腫瘤惡性生長(zhǎng)中起到關(guān)鍵作用但仍不能作為治療和觀察預(yù)后的單一靶標(biāo)，這為研究針對(duì)缺氧動(dòng)態(tài)變化的抗晚期前列腺癌研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。