吳 聰，葛科立，路宗博，鄭 征，張金玉，薛美蘭，葛銀林

（青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021）

近年來我國人群中肥胖的患病率逐年升高，嚴(yán)重影響人們的生活，現(xiàn)今全世界已有大約7億人在病理學(xué)上屬于肥胖范疇，大約20億人存在超重情況[1]。肥胖導(dǎo)致脂肪聚集與體質(zhì)量增加，會引發(fā)心腦血管疾病、2型糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病等病狀，并且會加速衰老[2]。對于肥胖機(jī)制更深入的研究，有利于對肥胖的進(jìn)一步預(yù)防與治療。脂肪酸與肥胖治療關(guān)系密切，是人體重要的營養(yǎng)成分，n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是人體必需脂肪酸，具有抗炎作用，可以用來降血糖降血脂，預(yù)防腫瘤的發(fā)生[3-5]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs對于肥胖等神經(jīng)炎癥具有抑制的作用，而機(jī)理尚未完全研究清晰[6-7]。人體內(nèi)n-3 PUFAs的來源主要依靠魚油等食物攝入，在當(dāng)今的人類飲食中，n-6 PUFAs含量高，而n-3 PUFAs含量低，且因人體缺少n-3 PUFAs合成酶，不能自發(fā)生成n-3 PUFAs，因此在人體組織內(nèi)n-3 PUFAs的含量也較低，這種體內(nèi)n-6/n-3 PUFAs的高比率常是炎癥反應(yīng)的原因。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的fat-1基因能將n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs，提高體內(nèi)n-3 PUFAs的含量[8]。因此，利用基因工程得到的能自發(fā)生成n-3 PUFAs的fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠是用于n-3 PUFAs研究的理想模型動物[9]。n-3 PUFAs是細(xì)胞膜的重要組成部分，而外泌體是由胞膜組成的一類囊泡，為細(xì)胞間傳遞信號的重要載體，可攜帶特異性的核酸、蛋白質(zhì)等信號分子來調(diào)控其他細(xì)胞的生物學(xué)活性[10]。對于其中的miRNA，研究表明，與體內(nèi)脂肪代謝有密切關(guān)系[11-12]。miRNA是一種小型RNA分子，長度在20 個堿基左右，通過和其對應(yīng)的靶基因mRNA堿基配對，引導(dǎo)RNA沉默復(fù)合體對mRNA進(jìn)行降解或者抑制mRNA的翻譯來達(dá)到靶向調(diào)控對應(yīng)蛋白表達(dá)量的作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs通過抑制下丘腦的炎癥影響肥胖，而外泌體miRNA也能夠影響脂質(zhì)代謝。因此提出思路：n-3 PUFAs能否影響小鼠體內(nèi)的外泌體？是否可通過調(diào)控外泌體內(nèi)miRNA的水平來影響脂質(zhì)代謝與肥胖？具體會影響哪些因子？此思路的研究在現(xiàn)有學(xué)術(shù)界中較少，因此將各個部分進(jìn)行串聯(lián)或許可以更清晰地解釋n-3 PUFAs對肥胖的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)利用fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠，通過高脂飲食建立肥胖模型，分離小鼠血漿中的外泌體并提取RNA，運(yùn)用高通量測序與生物信息學(xué)分析的方法，觀察其中與肥胖相關(guān)的miRNA的變化，發(fā)現(xiàn)miRNA與靶基因的互作關(guān)系，研究n-3 PUFAs對外泌體中的miRNA以及靶基因的影響，以期探尋n-3 PUFAs調(diào)節(jié)體質(zhì)量、抑制肥胖的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠（能自發(fā)生成n-3 PUFAs）由美國哈佛醫(yī)學(xué)院Kang Jingxuan教授建立和贈送，經(jīng)澳門大學(xué)Wan Jianbo博士實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移至青島大學(xué)生物化學(xué)與分子學(xué)系動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。C57BL/6野生型小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006，使用許可證號為SYXK（京）2017-0022。

小RNA樣本試劑盒（TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit） 美國Illumina公司；RNA連接酶（T4 RNA Ligase 2truncated） 英國NEB公司；逆轉(zhuǎn)錄酶（SuperScript 1V Reverse Transcriptase） 美國Thermo Fisher Scientific公司；高靈敏DNA試劑盒（High Sensitivity DNA Kit） 美國Agilent公司；40%體積濃度丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Novex TBE Running Buffer，丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比例19∶1） 美國Thermo Fisher Scientific公司；一抗（兔抗鼠CD63）、二抗（標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗）美國Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Invitrogen Qubit 3.0熒光計(jì)、ABI 2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、NanoDrop200全自動核酸分析儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；2100生物芯片分析系統(tǒng) 美國Agilent Technologies公司；cbot Cluser Station測序簇生成系統(tǒng)、Hiseq 2500二代測序儀 美國Illumina公司；5417超速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)和血樣獲取

將fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠與相應(yīng)的C57BL/6野生型小鼠雜交，得到同窩fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠（對照）。將鑒定好的6 周齡同窩雄性小鼠分為4 組：fat-1普通飲食組（ND-FAT-1）、野生普通飲食組（ND-WT）、fat-1高脂飲食組（HFD-FAT-1）和野生高脂飲食組（HFDWT），每組6 只，平均體質(zhì)量（19.023±0.304）g，各組小鼠的初始體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高脂飲食組食用高脂飼料，普通飲食組食用普通飼料，飲食和飲水不加限制，自由獲取，進(jìn)行8 周的飼養(yǎng)，電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，游標(biāo)卡尺測量小鼠體長，并且按照公式計(jì)算Lee’s指數(shù)。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。模型建立成功后對小鼠進(jìn)行眼球取血，加入抗凝劑并制成血漿保存使用。

1.3.2 外泌體提取和鑒定

任意選取1 只HFD-FAT-1組小鼠，采取超速差速離心法提取其血漿中的外泌體。按照外泌體國際研究要求，鑒定外泌體及其功能從以下3 個方面進(jìn)行：使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察外泌體微結(jié)構(gòu)；利用納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術(shù)對顆粒進(jìn)行跟蹤，可清晰地區(qū)分不同顆粒，觀測外泌體的濃度與粒子分布；進(jìn)行外泌體表面標(biāo)志蛋白表達(dá)的CD63抗體鑒定，對外泌體表面標(biāo)志物CD63進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）追蹤表達(dá)鑒定。

1.3.3 RNA測序

分離提取外泌體中的總RNA，利用T4 RNA連接酶通過連接接頭反應(yīng)的方法構(gòu)建miRNA-seq文庫，通過上海天昊公司的lllumina平臺進(jìn)行miRNAs高通量測序，該平臺運(yùn)用雙端測序策略進(jìn)行測序，可以一次獲得數(shù)百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同狀態(tài)下已知的和未知的miRNA及其表達(dá)差異。測序結(jié)果通過FASTX-Toolkit軟件過濾，去掉不符合條件的雜質(zhì)序列。隨后依次把質(zhì)控后的過濾序列與miRBase數(shù)據(jù)庫中的成熟miRNA序列進(jìn)行BLAST比對，并與Rfam數(shù)據(jù)庫和參考基因組比對，給出不同類型小RNA注釋結(jié)果。統(tǒng)計(jì)注釋到不同類型的小RNA的數(shù)目以及比例，觀察其中miRNA的情況，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到要求。

1.3.4 miRNA差異表達(dá)分析

對比fat-1高脂飲食組和和野生高脂飲食組，觀察fat-1基因所代表的n-3 PUFAs對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖類型小鼠產(chǎn)生的作用，根據(jù)數(shù)據(jù)庫得出樣本中已知miRNA及其表達(dá)狀況，同時(shí)利用miRNA特定的前體發(fā)卡結(jié)構(gòu)來預(yù)測新miRNA的表達(dá)結(jié)果。對比組間具有顯著差異表達(dá)的miRNA（P＜0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≠1），并根據(jù)已知的miRNA表達(dá)水平，利用R軟件包DESeq2工具篩選出差異表達(dá)的miRNA，觀察差異miRNA在不同樣本中的具體差異情況。

1.3.5 差異miRNA的靶基因分析及靶基因功能聚類

利用分析平臺miRWalk3.0分析其靶基因，將篩選壓力設(shè)置為連接P值（bindingP-value）＞0.8，結(jié)合區(qū)域打分值（tot score）＞800。對比TargetScan、miRDB和miTarBase 3 個數(shù)據(jù)庫，得到上述差異表達(dá)miRNA的靶基因的最終結(jié)果。依據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因功能預(yù)測，包括分析差異表達(dá)miRNA的靶基因主要參與的生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，篩選顯著富集的KEGG通路（P＜0.05且靶基因個數(shù)＞1）。隨后進(jìn)行肥胖相關(guān)miRNA篩選，從結(jié)果中選擇和肥胖與脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路，在這些通路中查找本實(shí)驗(yàn)參與的靶基因，找出與這些靶基因相對應(yīng)的差異表達(dá)miRNA并且進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異表達(dá)miRNA使用火山圖和聚類熱圖分析，miRNA-靶基因互作關(guān)系以及通路情況使用Cytoscape軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲食對小鼠生長的影響

肥胖模型建立成功，連續(xù)測定各組小鼠反映肥胖的生理指標(biāo)，結(jié)果如表1所示，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量、體長和Lee’s指數(shù)與相同飲食的野生型小鼠（對照組）相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.512，P＜0.05）。結(jié)果提示n-3多PUFAs的體內(nèi)含量上升能夠有效降低小鼠的體質(zhì)量，具有減輕肥胖程度的作用。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在不同飲食情況下體質(zhì)量、體長、Lee’s指數(shù)情況Table 1 Body masses, body lengths and Lee’s indexes of transgenic mice and wild-type mice fed different diets

2.2 血漿外泌體提取和鑒定結(jié)果

圖1 外泌體鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of exosomes

HFD-FAT-1組小鼠血漿中外泌體樣本鑒定結(jié)果如圖1所示，圖1A中，通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)了樣本中標(biāo)準(zhǔn)的茶杯狀外泌體膜泡結(jié)構(gòu)，且直徑在120 nm左右；通過WB實(shí)驗(yàn)對CD63表達(dá)追蹤鑒定，如圖1B所示，樣本內(nèi)CD63高度表達(dá)，含有外泌體，而對照組樣本內(nèi)無CD63表達(dá)。使用粒徑檢測顆粒分析技術(shù)結(jié)果如圖1C～E所示，樣本顆粒直徑集中在120 nm左右，且此類顆粒占比在90%以上，純度高。鑒定結(jié)果表明，外泌體提取成功，說明本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及后續(xù)分析是建立在外泌體樣本基礎(chǔ)上的。

2.3 RNA與測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

表2 外泌體總RNA檢測結(jié)果Table 2 Results of total RNA detection in exosomes

外泌體的總RNA質(zhì)檢結(jié)果如表2所示，樣本內(nèi)RNA總質(zhì)量均在2 ng以上，質(zhì)量濃度均在0.2 ng/μL以上，小于200 nt的RNA片段占總RNA的比例均大于80%，RNA質(zhì)量結(jié)果達(dá)到要求，質(zhì)量濃度和純度滿足建庫的需求。

表3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Quality control statistics of sequencing data

由測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控統(tǒng)計(jì)表（表3）可知，樣本有效序列比例占80%及以上，比對到數(shù)據(jù)庫中的成熟miRNA數(shù)目超過1 000。整理數(shù)據(jù)后，統(tǒng)計(jì)了有效序列中的不同類型小RNA的數(shù)目以及占比情況，結(jié)果如圖2所示，miRNA占據(jù)主要部分，占60%以上，說明樣本內(nèi)含有的miRNA質(zhì)量高數(shù)目多，且雜質(zhì)數(shù)據(jù)少。結(jié)合表2，進(jìn)一步說明了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性。

圖2 有效序列中各小RNA分類注釋圖Fig.2 Classification and annotation of small RNAs in effective sequences

2.4 fat-1高脂飲食組小鼠具有特異的外泌體miRNA表達(dá)譜

進(jìn)行分析后，各樣品已知miRNA和新預(yù)測的miRNA的基因表達(dá)量分析結(jié)果見表4。fat-1高脂飲食組已知miRNA的表達(dá)量平均值為962，野生型高脂飲食組的表達(dá)量平均值為1 049，兩組之間沒有顯著差異（P＞0.05），均有大量表達(dá)的已知miRNA。

表4 miRNA表達(dá)量分析Table 4 miRNA expression analysis

圖3 樣本間具有顯著差異性表達(dá)的miRNA的火山圖和聚類熱圖Fig.3 Volcano map and cluster heat map of significantly differentially expressed miRNAs among samples

根據(jù)miRNA差異表達(dá)情況，篩選P＜0.05且log2FC≠0的miRNA作為顯著差異表達(dá)的miRNA，其數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3、表5所示。篩選結(jié)果中具有特異性顯著差異表達(dá)的miRNA 107 個，已知miRNA中46 個，新預(yù)測miRNA中61 個。在已知的miRNA中，表達(dá)上調(diào)29 個，表達(dá)下調(diào)17 個；在新預(yù)測miRNA中，表達(dá)上調(diào)47 個，表達(dá)下調(diào)14 個。結(jié)果表明，在n-3 PUFAs的影響下，外泌體內(nèi)出現(xiàn)了miRNA的顯著差異表達(dá)的情況，分別存在表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNA，提示n-3 PUFAs可以有效調(diào)控miRNA的表達(dá)。

表5 高脂飲食組與對照相比顯著差異的miRNA數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 Statistics of significantly differential expressed miRNAs in high-fat diet group compared to the control group

2.5 6 個差異表達(dá)miRNA的靶基因處于脂質(zhì)代謝相關(guān)通路的關(guān)鍵位置

利用miRanda和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫工具，預(yù)測分析46 個差異表達(dá)的已知miRNA，獲得上千個數(shù)據(jù)庫中標(biāo)示被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過的靶基因。制作miRNA-靶基因互作圖（圖4），發(fā)現(xiàn)其關(guān)系復(fù)雜，miRNA會調(diào)控多個不同的靶基因，部分靶基因可能同時(shí)受到多個miRNA的調(diào)節(jié)，它們之間的相互作用會交叉形成網(wǎng)絡(luò)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示n-3 PUFAs產(chǎn)生的效應(yīng)可以影響多個靶基因所代表的多個通路的代謝狀況。

圖4 部分差異表達(dá)的miRNA與靶基因互作圖Fig.4 Interaction of partial differentially expressed miRNAs with target genes

利用clusterProfiler篩選顯著富集的KEGG通路，結(jié)果如圖5所示，靶基因與PI3K/Akt通路、內(nèi)吞通路、Ras通路等多個通路相關(guān)，其中內(nèi)吞通路是密切影響脂質(zhì)代謝而且與外泌體相關(guān)的經(jīng)典通路，內(nèi)吞可以通過質(zhì)膜的作用形成囊泡輸送脂蛋白等物質(zhì)，而外泌體也是微小囊泡，二者存在關(guān)聯(lián)性，囊泡所包含的物質(zhì)即為需研究的miRNA。內(nèi)吞通路簡要情況如圖6所示，篩選出的miRNA的多個靶基因在內(nèi)吞通路中的關(guān)鍵位置，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測n-3 PUFA能夠影響脂質(zhì)代謝和肥胖的外泌體miRNA機(jī)制，其中的miRNA與靶基因互作情況如圖7所示。

圖5 KEGG富集通路散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter diagram of Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) enrichment pathway

圖6 內(nèi)吞通路中miRNA和靶基因的互作圖Fig.6 Interaction between miRNAs and their target genes in endocytosis pathway

圖7 PUFAs代謝通路中miRNA和靶基因的互作圖Fig.7 Interaction between miRNAs and their target genes in unsaturated fatty acid metabolic pathway

在初步篩選中發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞通路中miRNA和靶基因關(guān)系較復(fù)雜，在已測的46 個差異表達(dá)miRNA中，需進(jìn)行更深層次篩選（P＜0.001且FC＞1.5），得到差異表達(dá)最為顯著的miRNA 21 個，最終通路富集結(jié)果（表6）顯示miRNA與脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、PUFAs生物合成在內(nèi)的多個脂質(zhì)代謝相關(guān)通路有關(guān)，得到脂肪酸代謝通路有關(guān)靶基因有12 個，PUFAs生物合成通路有關(guān)靶基因有9 個。提示n-3多PUFAs不僅通過內(nèi)吞通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，或從表6中的通路進(jìn)行調(diào)控，其中包含PUFAs的代謝通路，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效性，小鼠體內(nèi)miRNA變化與n-3 PUFAs有關(guān)。

表6 深層次通路篩選情況Table 6 Screening of deep-level pathways

表7 血漿外泌體中可能與肥胖相關(guān)的miRNATable 7 Obesity-related miRNAs in plasma exosomes

根據(jù)miRNA-mRNA相互作用，篩選得到與肥胖相關(guān)的重要miRNA共6 個（表7），這些miRNA分別調(diào)控單個或多個靶基因，直接落在PUFAs生物合成通路的關(guān)鍵位置上參與調(diào)控，靶基因具體介紹見表8，分別影響不同代謝步驟。將6 個miRNA回歸到內(nèi)吞通路當(dāng)中，得到結(jié)果見表9。miRNA與靶基因的互作情況如圖7所示，分別產(chǎn)生不同作用。內(nèi)吞通路靶基因較多，依據(jù)此方法對其進(jìn)行了篩選，得到關(guān)聯(lián)性更高的靶基因。綜上結(jié)果提示，n-3 PUFAs或能調(diào)控這些靶基因的表達(dá)和脂質(zhì)代謝通路，減輕肥胖。

表8 差異表達(dá)的miRNA-靶基因Table 8 Differentially expressed miRNAs and their target genes

表9 血漿外泌體中可能與內(nèi)吞相關(guān)的miRNATable 9 miRNAs in exosomes associated with endocytosis

3 討 論

根據(jù)美國食品和藥物管理局最近調(diào)查結(jié)果顯示，全世界范圍內(nèi)肥胖人口的數(shù)量呈不斷增加的趨勢。全球?qū)τ诜逝值年P(guān)注極為密切，不斷有新類型的藥物面世以治療肥胖，但用藥程度和療效仍未達(dá)到預(yù)期，且對人體有諸多副作用。因此，從食物方面入手才是預(yù)防/治療肥胖的最佳策略。例如，n-3 PUFAs是人體必需的營養(yǎng)成分，以二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸為代表的n-3 PUFAs有抗癌抗炎的作用，可以顯著降低血漿甘油三酯、類脂和脂蛋白的水平，降低體脂含量，促進(jìn)脂肪充分利用。研究證明，肥胖是一種慢性神經(jīng)炎癥，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，下丘腦可接受激素作為傳入信號，并進(jìn)行整合，通過傳出信號調(diào)節(jié)機(jī)體能量消耗、新陳代謝等生理進(jìn)程，課題組前期研究表明n-3 PUFAs具有抑制肥胖發(fā)生的作用，它能夠上調(diào)下丘腦中基礎(chǔ)水平的自噬反應(yīng)，抑制下丘腦炎癥因子、趨化因子的表達(dá)，緩解下丘腦炎癥反應(yīng)，維持了下丘腦的正常功能和能量平衡，進(jìn)而維持機(jī)體全身的能量平衡，減少外周脂肪的堆積，使外周炎癥反應(yīng)降低，降低了體質(zhì)量，但其具體上游作用機(jī)理尚未完全清晰，正在探索中[13-15]。外泌體是重要的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)中介，也可通過其分泌物進(jìn)行信號傳導(dǎo)，外泌體是一種微小型膜泡，直徑約40～120 nm，能夠被絕大多數(shù)細(xì)胞分泌，其內(nèi)部包含了復(fù)雜的內(nèi)容，對于其中的miRNA，研究表明，外泌體miRNA是一種循環(huán)miRNA，可以攜帶信息在不同細(xì)胞、組織與器官之間傳遞，外泌體通過miRNA抑制各類靶基因，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝的調(diào)控，患有代謝異常（例如肥胖）的患者與健康個體之間存在不同的循環(huán)miRNA譜。

根據(jù)本研究得到的數(shù)據(jù)，從通路富集結(jié)果中得到的miRNA（mmu-miR-122-3p、mmu-miR-122-5p、mmumiR-34c-5p、mmu-miR-665-3p、mmu-miR-194-5p、mmu-miR-223-3p）都是經(jīng)驗(yàn)證過的在人體代謝中發(fā)揮非常重要作用的miRNA，可能成為肥胖和相關(guān)代謝異常的潛在生物標(biāo)志物，也是有望用于治療肥胖和相關(guān)疾病的新治療靶標(biāo)。篩選到的靶基因?qū)χ|(zhì)代謝調(diào)控也非常重要，這些靶基因與肥胖的關(guān)系尚未被發(fā)現(xiàn)，例如靶基因Acot2，其產(chǎn)物是?；o酶A硫酯酶家族成員之一，其將?；o酶A水解成游離脂肪酸和輔酶A，在脂肪酸代謝中發(fā)揮重要的作用，受到miR-665-3p的調(diào)控，而它與肥胖的具體關(guān)系鮮有研究介紹，其他篩選到的靶基因同樣如此，深入研究n-3 PUFAs通過miRNA對肥胖的影響具有很大的價(jià)值，也為臨床相關(guān)的治療以及新作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供更多參考依據(jù)。

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官。miR-122在肝臟中特異性表達(dá)，是一種控制肝臟脂質(zhì)代謝的重要相關(guān)miRNA，它控制膽固醇與脂肪酸的合成，與肥胖相關(guān)對蛋白脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)有重要作用[16]。最新研究結(jié)果顯示，miR-122和許多的疾病尤其是肝癌有著非常密切的關(guān)系[17]，如miR-122可能會抑制正常的肝細(xì)胞變成惡性腫瘤細(xì)胞[18]。

miR-34是在許多癌癥中特異性表達(dá)的miRNA[19]。miR-34可以被p53基因激活，抑制腫瘤細(xì)胞的活動，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]；最近研究表明，它和脂肪生成以及肥胖也有非常密切的關(guān)系，可以控制相關(guān)脂肪酸的合成[22]。

miR-665對細(xì)胞凋亡有較大影響，在肝癌中有特異性的表達(dá)，與肝癌作用的具體機(jī)制還未明確[23]。miR-194同樣受到p53基因調(diào)控，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它在肝臟中靶向調(diào)控了癌細(xì)胞的活性與凋亡[24]。miR-223在炎癥中的發(fā)揮著重要的作用，會影響炎癥因子的表達(dá)[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)這些miRNA受到n-3 PUFAs的調(diào)控，其與肥胖的關(guān)系尚未確定，但在本研究中發(fā)現(xiàn)其可以受到n-3 PUFAs的調(diào)控，這些是其他學(xué)者尚未深入研究過的，推測可能是調(diào)控肥胖的重要因素，目前證實(shí)與肥胖相關(guān)的miRNA仍較少，miRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的重要開關(guān)，能參與幾乎所有生理病理活動，有必要進(jìn)一步深入研究其與脂質(zhì)代謝以及細(xì)胞各種代謝的關(guān)系。

本研究的結(jié)果顯示：n-3 PUFAs能影響小鼠血液外泌體內(nèi)這些miRNA的表達(dá)水平，同時(shí)能使小鼠體質(zhì)量降低。因此推測這些miRNA與肥胖有關(guān)，或許可以成為判斷肥胖水平的新標(biāo)志物[26]。另外，通過控制這些miRNA的表達(dá)，對相關(guān)通路造成影響，可能成為治療肥胖的新思路[27-28]。隨著對miRNA的研究越來越深入，目前已經(jīng)產(chǎn)生了miRNA模擬物療法，一些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[29-32]。例如，本實(shí)驗(yàn)篩選測到的miR-34，被用來治療肝癌，因?yàn)樗梢砸鸢┘?xì)胞的凋亡[33-35]。目前發(fā)現(xiàn)它同樣對肥胖有調(diào)節(jié)作用。這提示可以使用miR-34等miRNA類似物來治療肥胖或神經(jīng)炎癥。當(dāng)然具體方案還有待于研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，n-3 PUFAs能有效地使小鼠體質(zhì)量下降，并且可以影響到外泌體中和脂質(zhì)代謝有關(guān)的miRNA的表達(dá)，小鼠具有特異的外泌體miRNA表達(dá)譜。這些顯著變化的miRNA所調(diào)控的靶基因大都集中在調(diào)控脂質(zhì)代謝的分子通路中。這可能就是n-3 PUFAs降低體質(zhì)量、抑制肥胖的機(jī)理之一。調(diào)控體內(nèi)miRNA的水平可能是未來預(yù)防/防治肥胖的潛在策略。