吳 聰，葛科立，路宗博，鄭 征，張金玉，薛美蘭，葛銀林

（青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266021）

近年來我國人群中肥胖的患病率逐年升高，嚴重影響人們的生活，現今全世界已有大約7億人在病理學上屬于肥胖范疇，大約20億人存在超重情況[1]。肥胖導致脂肪聚集與體質量增加，會引發(fā)心腦血管疾病、2型糖尿病、呼吸系統疾病等病狀，并且會加速衰老[2]。對于肥胖機制更深入的研究，有利于對肥胖的進一步預防與治療。脂肪酸與肥胖治療關系密切，是人體重要的營養(yǎng)成分，n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是人體必需脂肪酸，具有抗炎作用，可以用來降血糖降血脂，預防腫瘤的發(fā)生[3-5]。本課題組研究發(fā)現，n-3 PUFAs對于肥胖等神經炎癥具有抑制的作用，而機理尚未完全研究清晰[6-7]。人體內n-3 PUFAs的來源主要依靠魚油等食物攝入，在當今的人類飲食中，n-6 PUFAs含量高，而n-3 PUFAs含量低，且因人體缺少n-3 PUFAs合成酶，不能自發(fā)生成n-3 PUFAs，因此在人體組織內n-3 PUFAs的含量也較低，這種體內n-6/n-3 PUFAs的高比率常是炎癥反應的原因。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的fat-1基因能將n-6 PUFAs轉化為n-3 PUFAs，提高體內n-3 PUFAs的含量[8]。因此，利用基因工程得到的能自發(fā)生成n-3 PUFAs的fat-1轉基因小鼠是用于n-3 PUFAs研究的理想模型動物[9]。n-3 PUFAs是細胞膜的重要組成部分，而外泌體是由胞膜組成的一類囊泡，為細胞間傳遞信號的重要載體，可攜帶特異性的核酸、蛋白質等信號分子來調控其他細胞的生物學活性[10]。對于其中的miRNA，研究表明，與體內脂肪代謝有密切關系[11-12]。miRNA是一種小型RNA分子，長度在20 個堿基左右，通過和其對應的靶基因mRNA堿基配對，引導RNA沉默復合體對mRNA進行降解或者抑制mRNA的翻譯來達到靶向調控對應蛋白表達量的作用。本課題組前期的研究發(fā)現，n-3 PUFAs通過抑制下丘腦的炎癥影響肥胖，而外泌體miRNA也能夠影響脂質代謝。因此提出思路：n-3 PUFAs能否影響小鼠體內的外泌體？是否可通過調控外泌體內miRNA的水平來影響脂質代謝與肥胖？具體會影響哪些因子？此思路的研究在現有學術界中較少，因此將各個部分進行串聯或許可以更清晰地解釋n-3 PUFAs對肥胖的抑制作用。本實驗利用fat-1轉基因小鼠，通過高脂飲食建立肥胖模型，分離小鼠血漿中的外泌體并提取RNA，運用高通量測序與生物信息學分析的方法，觀察其中與肥胖相關的miRNA的變化，發(fā)現miRNA與靶基因的互作關系，研究n-3 PUFAs對外泌體中的miRNA以及靶基因的影響，以期探尋n-3 PUFAs調節(jié)體質量、抑制肥胖的機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級fat-1轉基因小鼠（能自發(fā)生成n-3 PUFAs）由美國哈佛醫(yī)學院Kang Jingxuan教授建立和贈送，經澳門大學Wan Jianbo博士實驗室，轉移至青島大學生物化學與分子學系動物實驗中心飼養(yǎng)。C57BL/6野生型小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0006，使用許可證號為SYXK（京）2017-0022。

小RNA樣本試劑盒（TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit） 美國Illumina公司；RNA連接酶（T4 RNA Ligase 2truncated） 英國NEB公司；逆轉錄酶（SuperScript 1V Reverse Transcriptase） 美國Thermo Fisher Scientific公司；高靈敏DNA試劑盒（High Sensitivity DNA Kit） 美國Agilent公司；40%體積濃度丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Novex TBE Running Buffer，丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺質量比例19∶1） 美國Thermo Fisher Scientific公司；一抗（兔抗鼠CD63）、二抗（標記山羊抗兔IgG二抗）美國Abcam公司。

1.2 儀器與設備

Invitrogen Qubit 3.0熒光計、ABI 2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、NanoDrop200全自動核酸分析儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；2100生物芯片分析系統 美國Agilent Technologies公司；cbot Cluser Station測序簇生成系統、Hiseq 2500二代測序儀 美國Illumina公司；5417超速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)和血樣獲取

將fat-1轉基因小鼠與相應的C57BL/6野生型小鼠雜交，得到同窩fat-1轉基因小鼠與野生型小鼠（對照）。將鑒定好的6 周齡同窩雄性小鼠分為4 組：fat-1普通飲食組（ND-FAT-1）、野生普通飲食組（ND-WT）、fat-1高脂飲食組（HFD-FAT-1）和野生高脂飲食組（HFDWT），每組6 只，平均體質量（19.023±0.304）g，各組小鼠的初始體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。高脂飲食組食用高脂飼料，普通飲食組食用普通飼料，飲食和飲水不加限制，自由獲取，進行8 周的飼養(yǎng)，電子天平稱量小鼠體質量，游標卡尺測量小鼠體長，并且按照公式計算Lee’s指數。

對數據進行統計學處理分析。模型建立成功后對小鼠進行眼球取血，加入抗凝劑并制成血漿保存使用。

1.3.2 外泌體提取和鑒定

任意選取1 只HFD-FAT-1組小鼠，采取超速差速離心法提取其血漿中的外泌體。按照外泌體國際研究要求，鑒定外泌體及其功能從以下3 個方面進行：使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察外泌體微結構；利用納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術對顆粒進行跟蹤，可清晰地區(qū)分不同顆粒，觀測外泌體的濃度與粒子分布；進行外泌體表面標志蛋白表達的CD63抗體鑒定，對外泌體表面標志物CD63進行蛋白質免疫印跡（Western blot，WB）追蹤表達鑒定。

1.3.3 RNA測序

分離提取外泌體中的總RNA，利用T4 RNA連接酶通過連接接頭反應的方法構建miRNA-seq文庫，通過上海天昊公司的lllumina平臺進行miRNAs高通量測序，該平臺運用雙端測序策略進行測序，可以一次獲得數百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同狀態(tài)下已知的和未知的miRNA及其表達差異。測序結果通過FASTX-Toolkit軟件過濾，去掉不符合條件的雜質序列。隨后依次把質控后的過濾序列與miRBase數據庫中的成熟miRNA序列進行BLAST比對，并與Rfam數據庫和參考基因組比對，給出不同類型小RNA注釋結果。統計注釋到不同類型的小RNA的數目以及比例，觀察其中miRNA的情況，確保數據質量達到要求。

1.3.4 miRNA差異表達分析

對比fat-1高脂飲食組和和野生高脂飲食組，觀察fat-1基因所代表的n-3 PUFAs對高脂飲食誘導的肥胖類型小鼠產生的作用，根據數據庫得出樣本中已知miRNA及其表達狀況，同時利用miRNA特定的前體發(fā)卡結構來預測新miRNA的表達結果。對比組間具有顯著差異表達的miRNA（P＜0.05，差異倍數（fold change，FC）≠1），并根據已知的miRNA表達水平，利用R軟件包DESeq2工具篩選出差異表達的miRNA，觀察差異miRNA在不同樣本中的具體差異情況。

1.3.5 差異miRNA的靶基因分析及靶基因功能聚類

利用分析平臺miRWalk3.0分析其靶基因，將篩選壓力設置為連接P值（bindingP-value）＞0.8，結合區(qū)域打分值（tot score）＞800。對比TargetScan、miRDB和miTarBase 3 個數據庫，得到上述差異表達miRNA的靶基因的最終結果。依據京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫進行靶基因功能預測，包括分析差異表達miRNA的靶基因主要參與的生化代謝和信號轉導通路，篩選顯著富集的KEGG通路（P＜0.05且靶基因個數＞1）。隨后進行肥胖相關miRNA篩選，從結果中選擇和肥胖與脂質代謝相關的通路，在這些通路中查找本實驗參與的靶基因，找出與這些靶基因相對應的差異表達miRNA并且進行驗證。

1.4 數據處理與分析

數據采用統計學軟件SPSS 17.0進行分析，t檢驗比較兩組間的差異，實驗數據用平均值±標準差表示，P＜0.05時認為差異具有統計學意義。差異表達miRNA使用火山圖和聚類熱圖分析，miRNA-靶基因互作關系以及通路情況使用Cytoscape軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 飲食對小鼠生長的影響

肥胖模型建立成功，連續(xù)測定各組小鼠反映肥胖的生理指標，結果如表1所示，fat-1轉基因小鼠體質量、體長和Lee’s指數與相同飲食的野生型小鼠（對照組）相比明顯下降，差異具有統計學意義（t＝5.512，P＜0.05）。結果提示n-3多PUFAs的體內含量上升能夠有效降低小鼠的體質量，具有減輕肥胖程度的作用。

表1 轉基因小鼠與野生型小鼠在不同飲食情況下體質量、體長、Lee’s指數情況Table 1 Body masses, body lengths and Lee’s indexes of transgenic mice and wild-type mice fed different diets

2.2 血漿外泌體提取和鑒定結果

圖1 外泌體鑒定結果Fig.1 Identification of exosomes

HFD-FAT-1組小鼠血漿中外泌體樣本鑒定結果如圖1所示，圖1A中，通過TEM觀察發(fā)現了樣本中標準的茶杯狀外泌體膜泡結構，且直徑在120 nm左右；通過WB實驗對CD63表達追蹤鑒定，如圖1B所示，樣本內CD63高度表達，含有外泌體，而對照組樣本內無CD63表達。使用粒徑檢測顆粒分析技術結果如圖1C～E所示，樣本顆粒直徑集中在120 nm左右，且此類顆粒占比在90%以上，純度高。鑒定結果表明，外泌體提取成功，說明本實驗數據以及后續(xù)分析是建立在外泌體樣本基礎上的。

2.3 RNA與測序數據質控結果

表2 外泌體總RNA檢測結果Table 2 Results of total RNA detection in exosomes

外泌體的總RNA質檢結果如表2所示，樣本內RNA總質量均在2 ng以上，質量濃度均在0.2 ng/μL以上，小于200 nt的RNA片段占總RNA的比例均大于80%，RNA質量結果達到要求，質量濃度和純度滿足建庫的需求。

表3 測序數據質控統計結果Table 3 Quality control statistics of sequencing data

由測序數據的質控統計表（表3）可知，樣本有效序列比例占80%及以上，比對到數據庫中的成熟miRNA數目超過1 000。整理數據后，統計了有效序列中的不同類型小RNA的數目以及占比情況，結果如圖2所示，miRNA占據主要部分，占60%以上，說明樣本內含有的miRNA質量高數目多，且雜質數據少。結合表2，進一步說明了實驗數據的有效性。

圖2 有效序列中各小RNA分類注釋圖Fig.2 Classification and annotation of small RNAs in effective sequences

2.4 fat-1高脂飲食組小鼠具有特異的外泌體miRNA表達譜

進行分析后，各樣品已知miRNA和新預測的miRNA的基因表達量分析結果見表4。fat-1高脂飲食組已知miRNA的表達量平均值為962，野生型高脂飲食組的表達量平均值為1 049，兩組之間沒有顯著差異（P＞0.05），均有大量表達的已知miRNA。

表4 miRNA表達量分析Table 4 miRNA expression analysis

圖3 樣本間具有顯著差異性表達的miRNA的火山圖和聚類熱圖Fig.3 Volcano map and cluster heat map of significantly differentially expressed miRNAs among samples

根據miRNA差異表達情況，篩選P＜0.05且log2FC≠0的miRNA作為顯著差異表達的miRNA，其數目統計結果如圖3、表5所示。篩選結果中具有特異性顯著差異表達的miRNA 107 個，已知miRNA中46 個，新預測miRNA中61 個。在已知的miRNA中，表達上調29 個，表達下調17 個；在新預測miRNA中，表達上調47 個，表達下調14 個。結果表明，在n-3 PUFAs的影響下，外泌體內出現了miRNA的顯著差異表達的情況，分別存在表達上調和下調的miRNA，提示n-3 PUFAs可以有效調控miRNA的表達。

表5 高脂飲食組與對照相比顯著差異的miRNA數目統計結果Table 5 Statistics of significantly differential expressed miRNAs in high-fat diet group compared to the control group

2.5 6 個差異表達miRNA的靶基因處于脂質代謝相關通路的關鍵位置

利用miRanda和RNAhybrid數據庫工具，預測分析46 個差異表達的已知miRNA，獲得上千個數據庫中標示被實驗驗證過的靶基因。制作miRNA-靶基因互作圖（圖4），發(fā)現其關系復雜，miRNA會調控多個不同的靶基因，部分靶基因可能同時受到多個miRNA的調節(jié)，它們之間的相互作用會交叉形成網絡。實驗數據提示n-3 PUFAs產生的效應可以影響多個靶基因所代表的多個通路的代謝狀況。

圖4 部分差異表達的miRNA與靶基因互作圖Fig.4 Interaction of partial differentially expressed miRNAs with target genes

利用clusterProfiler篩選顯著富集的KEGG通路，結果如圖5所示，靶基因與PI3K/Akt通路、內吞通路、Ras通路等多個通路相關，其中內吞通路是密切影響脂質代謝而且與外泌體相關的經典通路，內吞可以通過質膜的作用形成囊泡輸送脂蛋白等物質，而外泌體也是微小囊泡，二者存在關聯性，囊泡所包含的物質即為需研究的miRNA。內吞通路簡要情況如圖6所示，篩選出的miRNA的多個靶基因在內吞通路中的關鍵位置，通過生物信息學分析預測n-3 PUFA能夠影響脂質代謝和肥胖的外泌體miRNA機制，其中的miRNA與靶基因互作情況如圖7所示。

圖5 KEGG富集通路散點圖Fig.5 Scatter diagram of Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) enrichment pathway

圖6 內吞通路中miRNA和靶基因的互作圖Fig.6 Interaction between miRNAs and their target genes in endocytosis pathway

圖7 PUFAs代謝通路中miRNA和靶基因的互作圖Fig.7 Interaction between miRNAs and their target genes in unsaturated fatty acid metabolic pathway

在初步篩選中發(fā)現內吞通路中miRNA和靶基因關系較復雜，在已測的46 個差異表達miRNA中，需進行更深層次篩選（P＜0.001且FC＞1.5），得到差異表達最為顯著的miRNA 21 個，最終通路富集結果（表6）顯示miRNA與脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、PUFAs生物合成在內的多個脂質代謝相關通路有關，得到脂肪酸代謝通路有關靶基因有12 個，PUFAs生物合成通路有關靶基因有9 個。提示n-3多PUFAs不僅通過內吞通路調節(jié)脂質代謝，或從表6中的通路進行調控，其中包含PUFAs的代謝通路，說明實驗數據有效性，小鼠體內miRNA變化與n-3 PUFAs有關。

表6 深層次通路篩選情況Table 6 Screening of deep-level pathways

表7 血漿外泌體中可能與肥胖相關的miRNATable 7 Obesity-related miRNAs in plasma exosomes

根據miRNA-mRNA相互作用，篩選得到與肥胖相關的重要miRNA共6 個（表7），這些miRNA分別調控單個或多個靶基因，直接落在PUFAs生物合成通路的關鍵位置上參與調控，靶基因具體介紹見表8，分別影響不同代謝步驟。將6 個miRNA回歸到內吞通路當中，得到結果見表9。miRNA與靶基因的互作情況如圖7所示，分別產生不同作用。內吞通路靶基因較多，依據此方法對其進行了篩選，得到關聯性更高的靶基因。綜上結果提示，n-3 PUFAs或能調控這些靶基因的表達和脂質代謝通路，減輕肥胖。

表8 差異表達的miRNA-靶基因Table 8 Differentially expressed miRNAs and their target genes

表9 血漿外泌體中可能與內吞相關的miRNATable 9 miRNAs in exosomes associated with endocytosis

3 討 論

根據美國食品和藥物管理局最近調查結果顯示，全世界范圍內肥胖人口的數量呈不斷增加的趨勢。全球對于肥胖的關注極為密切，不斷有新類型的藥物面世以治療肥胖，但用藥程度和療效仍未達到預期，且對人體有諸多副作用。因此，從食物方面入手才是預防/治療肥胖的最佳策略。例如，n-3 PUFAs是人體必需的營養(yǎng)成分，以二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸為代表的n-3 PUFAs有抗癌抗炎的作用，可以顯著降低血漿甘油三酯、類脂和脂蛋白的水平，降低體脂含量，促進脂肪充分利用。研究證明，肥胖是一種慢性神經炎癥，作為中樞神經系統的重要組成部分，下丘腦可接受激素作為傳入信號，并進行整合，通過傳出信號調節(jié)機體能量消耗、新陳代謝等生理進程，課題組前期研究表明n-3 PUFAs具有抑制肥胖發(fā)生的作用，它能夠上調下丘腦中基礎水平的自噬反應，抑制下丘腦炎癥因子、趨化因子的表達，緩解下丘腦炎癥反應，維持了下丘腦的正常功能和能量平衡，進而維持機體全身的能量平衡，減少外周脂肪的堆積，使外周炎癥反應降低，降低了體質量，但其具體上游作用機理尚未完全清晰，正在探索中[13-15]。外泌體是重要的細胞間信號傳導中介，也可通過其分泌物進行信號傳導，外泌體是一種微小型膜泡，直徑約40～120 nm，能夠被絕大多數細胞分泌，其內部包含了復雜的內容，對于其中的miRNA，研究表明，外泌體miRNA是一種循環(huán)miRNA，可以攜帶信息在不同細胞、組織與器官之間傳遞，外泌體通過miRNA抑制各類靶基因，參與體內脂質代謝的調控，患有代謝異常（例如肥胖）的患者與健康個體之間存在不同的循環(huán)miRNA譜。

根據本研究得到的數據，從通路富集結果中得到的miRNA（mmu-miR-122-3p、mmu-miR-122-5p、mmumiR-34c-5p、mmu-miR-665-3p、mmu-miR-194-5p、mmu-miR-223-3p）都是經驗證過的在人體代謝中發(fā)揮非常重要作用的miRNA，可能成為肥胖和相關代謝異常的潛在生物標志物，也是有望用于治療肥胖和相關疾病的新治療靶標。篩選到的靶基因對脂質代謝調控也非常重要，這些靶基因與肥胖的關系尚未被發(fā)現，例如靶基因Acot2，其產物是?；o酶A硫酯酶家族成員之一，其將酰基輔酶A水解成游離脂肪酸和輔酶A，在脂肪酸代謝中發(fā)揮重要的作用，受到miR-665-3p的調控，而它與肥胖的具體關系鮮有研究介紹，其他篩選到的靶基因同樣如此，深入研究n-3 PUFAs通過miRNA對肥胖的影響具有很大的價值，也為臨床相關的治療以及新作用靶點的發(fā)現提供更多參考依據。

肝臟是脂質代謝的重要器官。miR-122在肝臟中特異性表達，是一種控制肝臟脂質代謝的重要相關miRNA，它控制膽固醇與脂肪酸的合成，與肥胖相關對蛋白脂質代謝的調節(jié)有重要作用[16]。最新研究結果顯示，miR-122和許多的疾病尤其是肝癌有著非常密切的關系[17]，如miR-122可能會抑制正常的肝細胞變成惡性腫瘤細胞[18]。

miR-34是在許多癌癥中特異性表達的miRNA[19]。miR-34可以被p53基因激活，抑制腫瘤細胞的活動，促進細胞凋亡[20-21]；最近研究表明，它和脂肪生成以及肥胖也有非常密切的關系，可以控制相關脂肪酸的合成[22]。

miR-665對細胞凋亡有較大影響，在肝癌中有特異性的表達，與肝癌作用的具體機制還未明確[23]。miR-194同樣受到p53基因調控，已經研究發(fā)現它在肝臟中靶向調控了癌細胞的活性與凋亡[24]。miR-223在炎癥中的發(fā)揮著重要的作用，會影響炎癥因子的表達[25]。本研究中發(fā)現這些miRNA受到n-3 PUFAs的調控，其與肥胖的關系尚未確定，但在本研究中發(fā)現其可以受到n-3 PUFAs的調控，這些是其他學者尚未深入研究過的，推測可能是調控肥胖的重要因素，目前證實與肥胖相關的miRNA仍較少，miRNA作為基因表達調控的重要開關，能參與幾乎所有生理病理活動，有必要進一步深入研究其與脂質代謝以及細胞各種代謝的關系。

本研究的結果顯示：n-3 PUFAs能影響小鼠血液外泌體內這些miRNA的表達水平，同時能使小鼠體質量降低。因此推測這些miRNA與肥胖有關，或許可以成為判斷肥胖水平的新標志物[26]。另外，通過控制這些miRNA的表達，對相關通路造成影響，可能成為治療肥胖的新思路[27-28]。隨著對miRNA的研究越來越深入，目前已經產生了miRNA模擬物療法，一些已經進入臨床試驗階段[29-32]。例如，本實驗篩選測到的miR-34，被用來治療肝癌，因為它可以引起癌細胞的凋亡[33-35]。目前發(fā)現它同樣對肥胖有調節(jié)作用。這提示可以使用miR-34等miRNA類似物來治療肥胖或神經炎癥。當然具體方案還有待于研究。

綜上所述，本實驗結果提示，n-3 PUFAs能有效地使小鼠體質量下降，并且可以影響到外泌體中和脂質代謝有關的miRNA的表達，小鼠具有特異的外泌體miRNA表達譜。這些顯著變化的miRNA所調控的靶基因大都集中在調控脂質代謝的分子通路中。這可能就是n-3 PUFAs降低體質量、抑制肥胖的機理之一。調控體內miRNA的水平可能是未來預防/防治肥胖的潛在策略。