吳曉曉，張夢晨，楊鵬，武興康，馬開慶

（1.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006；3.山西大學 分子科學研究所，山西 太原 030006）

0 引言

百部（stemona japonica）作為藥用植物在我國已有上千年的應用歷史，作為其主要活性成分的百部生物堿（Stemonaalkaloids）是從直立百部（Stemo-na sessilifolia）和其近緣植物的根部分離得到的結構類似，具有相同生源的一類結構奇特且骨架變化多樣的生物堿[1]。迄今為止，已經有150多種百部生物堿從植物中分離出來[2]。此類天然產物具有多樣性的結構且具有顯著的生物學活性，包括鎮(zhèn)咳活性[3]，毒蕈堿 M5受體和 Sigma-受體結合活性[4]，逆轉多藥耐藥性[5]和 Pim-3激酶抑制活性[6]。在先前的研究中，我們通過使用路易斯酸催化串聯(lián)反應和催化羰基化合成了百部生物堿天然產物bisdehydroneostemoninine，bisdehydrostemoninine和 parvistemonine A[7-8]，這有利于后續(xù)天然產物類似物的制備和進一步的生物學評價。

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第四大最常被診斷出的癌癥，也是與癌癥相關死亡的第二大主要原因。近10年來我國結腸癌發(fā)病率呈明顯升高趨勢，據(jù)預測到2035年我國的結腸癌的發(fā)生率和死亡率都會有大幅度增加，嚴重威脅患者的健康和壽命[9]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是針對多種類型癌癥（包括CRC）的常用化療藥物，其主要通過抑制胸苷酸合酶（TS）并將其代謝物摻入RNA和DNA發(fā)揮其抗癌作用[10]，但5-FU的臨床療效隨著時間而顯著降低，這是由于癌細胞耐藥表型的發(fā)展所致。因此，進一步研究預防耐藥性癌癥形成對于增強CRC治療的效力至關重要[11]，發(fā)現(xiàn)具有顯著抑制HCT-8及其耐藥細胞株活性的新型骨架小分子具有重要的意義。本文報道了百部生物堿及其衍生物的合成及其對HCT-8/5-FU和HCT-8細胞毒性研究。

1 實驗部分

1.1 合成實驗

所有的實驗均在氬氣保護下干燥溶劑中進行。所有試劑均購自商業(yè)渠道，無需進一步純化即可使用。使用TMS作為內標，在環(huán)境溫度下于Bruker AV-600光譜儀（Bruker Co.Billerica，美國）上記錄NMR光譜。使用Thermo Scientific Q Exactive（Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham，USA）在質譜實驗室記錄高分辨率質譜（HRMS）。根據(jù)先前報道的方法制備天然產物bisdehydroneostemoninine（11）和衍生物 2、4-10[7]。衍生物 1根據(jù)先前報道的方法制備[8]。

1.2 生物測試

細胞培養(yǎng)：人結腸正常細胞系FHC和人CRC細胞系DLD1和HCT116細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，Manassas，VA，USA）。 HCT-8和HCT-8/5-氟尿嘧啶抗性細胞系（HCT-8/5-FU）從中國典型培養(yǎng)物保藏所（中國上海）獲得。這些細胞在補充有體積分數(shù)10%胎牛血清和1%青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長，并在裝有體積分數(shù)5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中于37°C孵育。

2 實驗方法

2.1 合成實驗

（3aR，10bR）-1-亞甲基-1，3a，4，5，6，6，10b-六氫-2H-呋喃[3，2-c]吡咯并[1，2-a]氮雜化合物（3）在-78 ℃下向（3aR，10bR）-1，3a，4，5，6，6，10b-六氫-2H-呋喃[3，2-c]吡咯并[1，2-a]氮雜-2-2-酮（50 mg 0.26 mmol）的 THF（12.5 mL）溶液中緩慢加入在中的雙（三甲基甲硅烷基）酰胺鋰（1.53 mL，0.5 mol/L，1.0 mmol），然后將所得混合物在相同溫度下攪拌0.5 h。向上述溶液中加入Eschenmoser salt（396 mg，2.14 mmol），然后將所得混合物緩慢升溫至-30℃。通過在-30℃下添加飽和NH4Cl溶液淬滅反應混合物，然后升至室溫。用EtOAc萃取反應混合物3次，并在真空下除去溶劑，得到黃色油，其無需進一步純化即可用于下一步。

向上述粗胺化合物的異丙醇（1.25 mL）溶液中加入 2-氯 4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪（35.5 mg，0.2 mmol）和三乙胺（20 mg，27 μL），0.2 mmol）。將混合物在室溫攪拌1.5 h并濃縮，得到殘余物，將其通過柱色譜法純化（PE：EA ＝ 1∶1），以55%的收率得到所需化合物29 mg。

2.2 生物測定

細胞活力測定：使用MTT測定法確定化合物3對指定細胞的抑制作用。將細胞以3×103/孔的密度分配在96孔板中，溫育過夜后在指定的時間段內用不同濃度的化合物3處理細胞。將20 μL MTT（5 mg/mL）添加到培養(yǎng)基中，并在37°C下孵育4 h。除去上清液后，將DMSO添加到每個孔中。在570 nm處測量吸光度。

菌落形成測定：將HCT-8細胞和HCT-8/5-FU細胞以每孔500個細胞的密度接種到6孔板。將細胞用各種濃度的化合物3處理14 d，并保持在37°C。用甲醇固定并用結晶紫染色后，在相差顯微鏡下捕獲菌落。

FITC-Annexin V/PI染色法檢測細胞凋亡：使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（Key-GEN BioTECH，南京，中國）進行FITC-Annexin V和PI細胞凋亡測定[12-14]。將HCT-8細胞用化合物3處理24 h后，收集細胞并用PBS洗滌，重懸于結合緩沖液中，與 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI在室溫下于室溫孵育20 min。通過流式細胞儀（BD bioscience，美國）分析凋亡細胞。

統(tǒng)計分析：數(shù)值表示至少三個獨立實驗的平均值±標準偏差（SD）。兩組之間的差異是使用t-檢驗確定的。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

3.1 化學

根據(jù)先前報道的方法制備了天然產物bisdehydroneostemoninine 和其衍生物 1-2，4-11[7-8]（如圖1所示）。化合物2在堿性條件下與Eschenmoser salt反應，得到二甲胺中間體12，其無需進一步純化即可用于下一步。首先探索了采用DBU進行甲基化和霍夫曼消除的常規(guī)方法，但該反應僅得到了雙鍵異構化化合物13而不是所需的產物3。注意到了一種簡便的一步法消除二甲基氨基，用2-氯-4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪和三乙胺在 Eschenmoser的亞甲基化反應中進行了研究，以55%的收率形成了化合物3。

圖1 Bisdehydroneostemoninine以及衍生物的結構Fig.1 Structures of bisdehydroneostemoninine（11）and its derivatives

圖2 化合物3的合成Fig.2 Synthesis of compound 3

3.2 生物活性

細胞化合物孵育24 h后，針對HCT-8/5-FU細胞篩選所有制備的化合物（如圖3所示），其中，天然產物bisdehydroneostemoninine對HCT-8/5-FU細胞沒有細胞毒活性。衍生物3在100 μmol/L的濃度下顯示出對HCT-8/5-FU細胞的有效細胞毒性作用。用乙基取代環(huán)外雙鍵，衍生物5顯示出弱的細胞毒性活性，而在羰基的α-位沒有取代基的衍生物2顯示沒有活性，這表明親電共價活性基團部分是至關重要的活性部分。

圖3 bisdehydroneostemoninine和它的衍生物的細胞毒性活性（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.3 Cytotoxic activities of the bisdehydroneostemoninine and its derivatives（*P＜0.05，**P＜0.01）

為了檢查以上觀察到的現(xiàn)象是否不僅限于HCT-8/5-FU細胞，用化合物3處理HCT-8，DLD1，HCT116和HCT-8/5-FU，化合物3和上述CRC細胞孵育24 h后的結果表明，化合物3以劑量依賴性方式抑制所有CRC細胞增殖。當CRC細胞系 于 100 μmol孵育24 h 時 ，HCT-8，HCT116 和HCT-8/5-FU的細胞存活率為40%～55%。值得注意的是，即使在100 μmol下，化合物3對正常結腸細胞FHC沒有顯著的抑制作用（圖4）。

圖4 化合物3劑量依賴抑制CRC細胞的生長（共孵育24 h）Fig.4 Compound 3 dose-dependently inhibited cell growth of CRC cells（incubation in 24 h）

進一步的研究表明，化合物3以時間依賴性方式抑制HCT-8和HCT-8/5-FU細胞中的細胞增殖（圖5），HCT-8和HCT-8/5-FU細胞與化合物3孵育24 h后出現(xiàn)細胞毒性，當濃度為20 μmol化合物3與HCT-8孵育72 h后，細胞存活率減少到50%，當濃度為50 μmol化合物3與HCT-8/5-FU孵育72 h后，細胞活力存活率減少到50%。

圖5 化合物3對CRC細胞增長的劑量和時間依賴抑制Fig.5 Compound 3 dose-and time-dependent inhibition of cell growth of CRC cells

為了進一步確定化合物3對CRC細胞增殖能力的抑制作用，評價了化合物3在50 μmol和100 μmol濃度時，對HCT-8和HCT-8/5-FU集落形成能力的長期抑制作用。結果表明：化合物3可以顯著地抑制兩種CRC細胞系的集落生長（圖6）。此外，流式細胞術實驗表明化合物3可以促進HCT-8細胞的細胞凋亡（圖7）。從以上結果可知，表明化合物3對能顯著抑制HCT-8和HCT-8/5-FU的增殖能力，并誘導其凋亡。

圖6 化合物3抑制細胞的集落形成Fig.6 Compound 3 inhibited colony formation of cells

圖7 化合物3誘導HCT-8細胞凋亡Fig.7 Compound 3 induced apoptosis in HCT-8 cells

4 結論

本文合成了bisdehydroneostemoninine和一系列百部生物堿衍生物，并評價了它們對HCT-8和HCT-8/5-FU細胞的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)具有百部生物堿骨架的小分子化合物3以劑量和時間依賴性方式誘導HCT-8和HCT-8/5-FU細胞凋亡；同時，該化合物還對其他不同遺傳背景的CRC細胞（DLD1，HCT116）具有顯著的抑制活性，但是其對正常結腸細胞（FHC）沒有作用，表明化合物3對CRC細胞的抑制具有一定的選擇性。上述研究結果表明化合物3對CRC細胞及其耐藥株具有顯著的抑制活性，且與現(xiàn)有臨床一線藥物5-FU的作用機制有區(qū)別，但是該類小分子是通過何種生物機制產生細胞毒性的需要進一步的研究。