曾蘭芬，張新敏，肖 雪，孫國(guó)亮，李浩波，張良清

（1 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科 廣東 湛江 524000）

（2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科 吉林 長(zhǎng)春 130000）

（3 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科 廣東 廣州 510000）

心肌缺血及再灌注后心肌細(xì)胞自身或浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞釋放大量活性氧（ROS），致大量心肌細(xì)胞死亡[1-2]。本文以H9C2 心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探索H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的濃度及處理時(shí)間。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

H9C2 心肌細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；H2O2溶液購(gòu)自ATT Bioquest 公司；CCK-8、活性氧及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；所用抗體購(gòu)自CST 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自thermo fisher 公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；高糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；PBS、雙抗（青/鏈霉素）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；酶標(biāo)測(cè)試儀購(gòu)自德國(guó)Berthoid 公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

從-80℃冰箱取出凍存的細(xì)胞，放于37℃水浴鍋內(nèi)使其迅速融化，加入等量完全培養(yǎng)基，離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按合適密度鋪板，置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%及以上時(shí)，予傳代處理。

1.2.2 氧化應(yīng)激模型建立

將H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板，待貼壁后，進(jìn)行后續(xù)處理。按H2O2濃度梯度將實(shí)驗(yàn)分為6 組：對(duì)照組、50μm H2O2組、100μm H2O2組、200μm H2O2組、300μm H2O2組及400μm H2O2組，各組加入不同H2O2濃度處理6 h，檢測(cè)細(xì)胞活力及LDH 水平，確定合適的H2O2濃度。按H2O2處理時(shí)間梯度將實(shí)驗(yàn)分為6 組，對(duì)照組、2 h 組、4 h 組、6 h 組、12 h 組及24 h 組，加入相同濃度H2O2，于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活力及LDH水平，確定H2O2合適的處理時(shí)間。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

將H9C2 心肌細(xì)胞接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁后，予相應(yīng)處理后，加CCK8 試劑10μl，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞上清LDH、MDA 及SOD 水平檢測(cè)

收集各組細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞上清OD 值，按公式計(jì)算出對(duì)應(yīng)數(shù)值。

1.2.5 細(xì)胞活性氧（ROS）水平檢測(cè)

按照活性氧檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，孵育完成后，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)單視野下陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.6 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

按分組處理細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，RAPI 裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法定量，SDS-PAGE 膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵一抗，4 ℃過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，孵二抗，室溫1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL 法曝光檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集細(xì)胞到1.5 mL 離心管中，加入100 μl Binding Buffer，吹打重懸細(xì)胞，避光加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，混勻后室溫（避光）孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，行t 檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激模型建立

H2O2濃度梯度實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比，50μm H2O2組及100μm H2O2組細(xì)胞活力及LDH 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；200μm H2O2組、300μm H2O2組及400μm H2O2組細(xì)胞活力降低、LDH 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。選取濃度為200μm H2O2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。H2O2處理時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組比，2 h 組及4 h 組細(xì)胞活力及LDH 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）；6 h 組、12 h 組及24 h 組細(xì)胞活力降低、LDH 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。其中12 h 組心肌細(xì)胞活力約為63%，適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以選擇200μm H2O2處理細(xì)胞12 h作為建立H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力及LDH 水平檢測(cè)（OD 值）

2.2 兩組氧化應(yīng)激水平比較

H2O2組心肌細(xì)胞ROS 陽(yáng)性細(xì)胞比例、MDA 水平均高于對(duì)照組，SOD 水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組ROS、MDA 及SOD 水平比較（OD 值）

2.3 細(xì)胞凋亡情況比較

H2O2組Bax、Cleaved/caspase-3 以及凋亡率均高于對(duì)照組，Bcl-2 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

3.討論

氧化應(yīng)激損傷致心肌細(xì)胞凋亡在心肌缺血及再灌注中起重要作用，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡模型的成功建立可為心肌梗死的臨床治療及藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具重大意義。而H2O2在各種活性氧（ROS）生產(chǎn)者中起核心作用[3]，用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是正確選擇。但目前用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的處理?xiàng)l件相差甚大[4-5]。本研究旨在探究H2O2誘導(dǎo)H9C2 心肌細(xì)胞凋亡合適的濃度及處理時(shí)間，結(jié)論是200μm H2O2處理H9C2 心肌細(xì)胞12h可明顯導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)H2O2性質(zhì)很不穩(wěn)定，建議分裝長(zhǎng)期存于-20℃，短期避光存于4℃。另外，H2O2品牌、細(xì)胞狀態(tài)以及操作因素等也會(huì)影響H2O2用量及處理時(shí)間。建議購(gòu)買濃度精確的H2O2，保證實(shí)驗(yàn)細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，以及保證實(shí)驗(yàn)操作的一致性。

綜上所述，本研究成功探索出H2O2誘導(dǎo)H9C2 心肌細(xì)胞凋亡的方法，并發(fā)現(xiàn)其中存在的問題及提出建議。將對(duì)后期H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建具有重要的指導(dǎo)意義。