◎ 楊豐旭，曹歡歡，李 爽，孟凡信

（朝陽(yáng)市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 朝陽(yáng) 122000）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在自然界分布廣泛，是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，可通過(guò)污染食品而引起人、畜單核細(xì)胞增多，從而導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等疾病[1]。作為食品中常見(jiàn)的致病菌之一，該菌對(duì)復(fù)雜環(huán)境耐受性強(qiáng)，且致病性較強(qiáng)，嚴(yán)重可致死，國(guó)家及各地方《食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》均將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌列為肉制品、奶制品等食品中致病菌類(lèi)必檢項(xiàng)目[2]。因此，為了提高李斯特氏菌檢測(cè)技術(shù)水平，本實(shí)驗(yàn)室參加了2020 年大連海關(guān)技術(shù)中心組織的能力驗(yàn)證，并分析了這次能力驗(yàn)證的過(guò)程與結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品由大連海關(guān)技術(shù)中心提供，共兩瓶，編號(hào)分別為075 和102，瓶?jī)?nèi)為乳白色凍干粉末（位于西林瓶底部）。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及耗材

李氏增菌肉湯（LB1、LB2）基礎(chǔ)（陸橋）、LB1及LB2添加劑（陸橋）；李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）、PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基（環(huán)凱）、羊血瓊脂平板（陸橋）、TSA-YE 瓊脂培養(yǎng)基（陸橋）、SIM 培養(yǎng)基（陸橋）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定盒（環(huán)凱）；VITEK 2 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌GP 鑒定卡（梅里埃）。

1.3 儀器及設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（BPX-272）、生化培養(yǎng)箱（BSP-150）、生物安全柜（BSC-1500 ⅡA2-X）、無(wú)菌均質(zhì)器（YIU-09）、相差顯微鏡（BPH-505E）、全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（VITEK 2 Compact）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC 21635）、伊氏李斯特氏菌（CICC 21663）、斯氏李斯特氏菌（CICC 21671）、 英諾克李斯特氏菌（CICC 10417）、金黃色葡萄球菌（CICC 10384）、馬紅球菌（CICC 22955）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)《PTC-T320 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)能力驗(yàn)證》作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，并依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30-2016）進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢測(cè)，同時(shí)以VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)作為輔助，用來(lái)分析鑒定可疑菌株，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最終報(bào)告。

1.6 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.6.1 樣品前處理

以無(wú)菌操作開(kāi)啟西林瓶，立即（1 min 內(nèi)）加入少量（2 ～4 mL）生理鹽水進(jìn)行再水化，將溶解后的液體吸出放入無(wú)菌瓶中，反復(fù)用余下的生理鹽水清洗西林瓶和膠塞，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，最終無(wú)菌瓶中的待測(cè)原液為25 mL，本過(guò)程20 min 內(nèi)完成。

1.6.2 一次增菌

將無(wú)菌瓶中的待測(cè)原液加入到含有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，均質(zhì)2 min，于30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.6.3 二次增菌

移取1.6.2 中LB1增菌液0.1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.6.4 選擇性分離

分別取1.6.2 中LB1增菌液及1.6.3 中LB2二次增菌液劃線接種于PALCAM 瓊脂平板和李斯特氏菌顯色平板上，于36 ℃培養(yǎng)24 ～48 h，觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。同時(shí)在選擇性平板上劃線接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌及英諾克李斯特氏菌作為對(duì)照菌株。

1.6.5 初篩

選取選擇性平板上3 ～5 個(gè)典型或可疑菌落接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)在TSA-YE 平板及羊血瓊脂平板上劃線，于36 ℃培養(yǎng)24 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定及生化實(shí)驗(yàn)。

1.6.6 鑒定及生化實(shí)驗(yàn)

按照GB 4789.30—2016 中5.4[3]及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6.7 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定實(shí)驗(yàn)

將GP 鑒定卡及0.45%NaCl 溶液從冰箱取出，置于室溫15 ～20 min，充分復(fù)溫。挑取1.6.5 中羊血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h的單菌落，加入裝有3 mL0.45%NaCl 溶液的一次配套性塑料試管中，制成0.50 ～0.63 麥?zhǔn)蠁挝唬ㄓ帽葷醿x測(cè)定）的菌懸液，隨后進(jìn)行上機(jī)分析鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 選擇性分離、初篩及生化實(shí)驗(yàn)

編號(hào)075 和102 的樣品經(jīng)一次增菌及二次增菌后的培養(yǎng)基均變渾濁，說(shuō)明這兩個(gè)樣品中含有可以在LB1和LB2增菌液中生長(zhǎng)的微生物。將LB1增菌液在PALCAM 及李斯特顯色培養(yǎng)基上劃線后的平板分別標(biāo)記為PALCAM-LB1及李顯-LB1，其中編號(hào)075樣品LB1增菌液經(jīng)選擇性分離培養(yǎng)后培養(yǎng)基上未出現(xiàn)典型菌落，其LB2增菌液經(jīng)選擇性分離培養(yǎng)后培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型菌落，編號(hào)102 樣品LB1和LB2增菌液經(jīng)選擇性分離培養(yǎng)后培養(yǎng)基上均出現(xiàn)典型菌落。將1.6.5中選取的典型菌落經(jīng)初篩及生化實(shí)驗(yàn)后均鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程及現(xiàn)象見(jiàn)表1。

2.1.2 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

VITEK 2 COMPACT 分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)樣品075 和102 中分離出的典型菌落均為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。

2.2 討論

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有較強(qiáng)的危害性及致病性，加大監(jiān)管檢測(cè)力度并發(fā)展高效、快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)技術(shù)能盡早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)處理該菌引起的食源性疾病、從最大程度上減少其對(duì)人體的健康危害。

表1 分離、初篩及生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

通常來(lái)說(shuō)，食品樣品含有的菌體種類(lèi)較多，一些食品加工方法會(huì)使目標(biāo)菌的活動(dòng)減弱、數(shù)量減少，不利于后續(xù)檢測(cè)工作的進(jìn)行。因此在進(jìn)行致病菌檢測(cè)時(shí)需采用增菌步驟對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行復(fù)蘇及修復(fù)，以達(dá)到快速繁殖的目的。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定單核細(xì)胞增生李斯特氏菌前增菌方法為二步增菌法，使用的培養(yǎng)基先后為L(zhǎng)B1和LB2。二步增菌的原因是樣品中的單增菌體往往處于非正常生長(zhǎng)狀態(tài)，如受熱傷、凍傷、高滲透壓等，這種狀態(tài)下對(duì)抑菌劑的敏感度比正常狀態(tài)要高，所以先通過(guò)用含有低濃度抑菌劑的LB1增菌液讓單增復(fù)蘇后，再用含有高濃度抑菌劑的LB2增菌液來(lái)抑制非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，從而使目標(biāo)菌的濃度能生長(zhǎng)到可檢出的水平。為了縮短檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到高效檢測(cè)的目的，本次實(shí)驗(yàn)在第一步LB1增菌結(jié)束后進(jìn)行了一次選擇性分離實(shí)驗(yàn)，其中編號(hào)075 的樣品經(jīng)LB2增菌、劃線后在選擇性分離平板上長(zhǎng)出典型菌落，而編號(hào)102 的樣品經(jīng)LB1增菌、劃線后在選擇性分離平板上就已長(zhǎng)出典型菌落，且以上典型菌落經(jīng)后期鑒定均確定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。分析這一結(jié)果，可能是編號(hào)075 樣品中的單增李斯特氏菌在一次增菌后未能充分復(fù)蘇，而編號(hào)102 樣品中的單增李斯特氏菌在一次增菌后就得到了充分的復(fù)蘇，已達(dá)到可檢測(cè)水平。因此，以本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有檢測(cè)水平來(lái)看，通過(guò)前期增菌、分離步驟，并結(jié)合全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)輔助檢測(cè)，可將總檢測(cè)周期最短控制在4 d 以內(nèi)，若僅通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)周期最長(zhǎng)可達(dá)7 d 以上。

此外，多數(shù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約β-溶血增強(qiáng)現(xiàn)象，少數(shù)（5%～8%）單增李斯特氏菌在靠近馬紅球菌一端出現(xiàn)溶血增強(qiáng)現(xiàn)象，本次實(shí)驗(yàn)從編號(hào)075 和102 樣品中分離出的典型菌株及陽(yáng)性對(duì)照菌均屬于后者，筆者分析“協(xié)同溶血”中有關(guān)特性應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)菌株的來(lái)源有關(guān)，提示檢測(cè)人員應(yīng)在實(shí)際的檢驗(yàn)工作中注意觀察具體實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，多積累相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。

3 結(jié)論

本次能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意，本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員的檢測(cè)能力得到了很好的鍛煉和提升，為基層檢驗(yàn)人員在單增李斯特氏菌的前增菌及分離步驟的操作上提供一定的參考思路。