◎ 馮 濤，陶 森，阮世勇，黎 獻(xiàn)，林對儉

（陽江市檢測檢驗(yàn)中心，廣東 陽江 529500）

鉤吻（Geisemium elegans）是馬錢科（Loganiaceae）葫蔓藤屬（Geisemium）植物[1]，為有毒中藥，古人形容其毒性猛烈“入口即鉤人喉吻”，故取名“鉤吻”，又稱“斷腸草”“大茶藥”，主要分布在東南亞國家和我國的南部地區(qū)（如福建、廣東、廣西等地）。鉤吻花、葉、根、莖均有劇毒，根部毒性最強(qiáng)。作為帶毒中藥多外用以治療皮膚病、風(fēng)濕、消腫止痛[2]。鉤吻藥性和毒性均來自于鉤吻堿，研究表明鉤吻堿具有抗腫瘤、抗焦慮、消炎鎮(zhèn)痛、促食欲的作用[3]，對肝臟、腎臟、睪丸和神經(jīng)中樞系統(tǒng)都有嚴(yán)重的毒性作用，能透過血腦屏障，在腦中的消除速度相對較慢，具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性[4]。中毒癥狀主要為口渴、流涎、惡心、嘔吐、抽搐、肌肉無力、四肢麻木、煩躁不安、心律失常、頭暈和呼吸困難等[5]。鉤吻藥用起效劑量同中毒劑量相近[6]，常因誤食及使用不當(dāng)引起中毒事件。而廣東陽江民間有使用鉤吻根煲湯的飲食習(xí)慣，時有劑量掌握不當(dāng)造成食物中毒，是該地區(qū)的高風(fēng)險食物中毒因子，近5 年來已發(fā)生4 起鉤吻堿中毒事件。因此，在該區(qū)域研究和開展鉤吻堿應(yīng)急檢測工作極為必要，對保障該區(qū)域食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

島津GCMS-TQ8050 氣相色譜串聯(lián)三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備EI 源，日本Shimadzu 公司）； KQ-250DV 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MS3 型漩渦振蕩器（德國IKA 公司）；sigma3-18ks高速冷凍離心機(jī)（德國sigma 公司）；TruboVap Ⅱ型吹氮濃縮儀（美國Caliper 公司）；0.22 μm 有機(jī)系針筒式微孔濾膜過濾器（上海ANPLE 公司）。

1.1.2 試劑

丙酮、正己烷（色譜純，德國Merck 公司）；氫氧化鈉和無水硫酸鈉為分析純；標(biāo)準(zhǔn)品鉤吻堿（純度99.0%），分子式C20H22N2O2，分子量322，美國Sigma 公司。

樣品：患者血液1、患者血液2、洗胃液1、洗胃液2、嘔吐物1 及患者家中采集的未食用完的食物：鉤吻根豬腳湯、白切雞、燒鵝、炒白菜、炒菜心，共計10 份。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃下保存。臨用前使用三氯甲烷梯度稀釋，配成質(zhì)量濃度分別為0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

分別取5.00 g 樣品，各加入10 mL10%NaOH，超聲振蕩提取10 min，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，加入5 mL 正己烷，振蕩5 min 進(jìn)行液液萃取，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾備用。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：進(jìn)樣口溫度200 ℃；進(jìn)樣量：1 μL，色譜柱為Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×100 mm，0.25 μm， 日本Shimadzu 公司），初始柱溫100 ℃，保持1 min， 以40 ℃ ·min-1升至280 ℃，保持 10 min；載氣為氦氣，恒定流速：1.2 L·min-1，不分流進(jìn)樣模式。

質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電壓70 eV；采集時間2 ～25 min；全掃描模式（Scan）掃描范圍50 ～350 amu；選擇離子模式（SIM）采集特征碎片離子（m/z）108、279、322、251。

1.2.4 定性定量方式

采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在Scan 模式下對樣品全掃描，所得數(shù)據(jù)使用Nist17 譜庫檢索定性；SIM 模式下依次測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品測試液，通過比較各特征碎片離子的豐度來進(jìn)一步確證。鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品各特征離子碎片豐度分別為：108（100%）、279（42%）、322（35%）、251（18%），并要求試樣中各離子的豐度不得超過標(biāo)準(zhǔn)的±20%。沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，可直接用譜庫檢索結(jié)果定性。

采用外標(biāo)法定量，選擇m/z108 為定量離子[7]，以標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)定量離子峰面積為縱坐標(biāo)制作校正曲線，待測目標(biāo)化合物定量離子峰面積與相應(yīng)校正曲線比較定量，應(yīng)急檢測中有時也采用單點(diǎn)外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 譜庫檢索結(jié)果

樣品在Scan 模式進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)鉤吻根豬腳湯、嘔吐物1、洗胃液1 三種樣品中有可疑峰，出峰時間為10.25 min，鉤吻根豬腳湯中峰面積最大，該可疑檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行Nist17 譜庫檢索，在湯和患者嘔吐物中發(fā)現(xiàn)鉤吻堿（相似度98%），鉤吻根豬腳湯樣品（圖1）中出現(xiàn)的4 個明顯的峰，依次命名為1 號～4 號峰，經(jīng)Nist17 譜庫檢索，3 號峰（圖2）為鉤吻堿，其他為香料物質(zhì)等。

圖1 鉤吻根豬腳湯ScanTIC 圖

圖2 3 號峰Scan 質(zhì)譜圖

在SIM 模 式（圖3）下 以m/z108、279、322、251 為監(jiān)測離子，依次進(jìn)樣鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和陽性樣品，進(jìn)行二級離子確證，其出峰時間一致、離子豐度比一致，結(jié)合譜庫檢索結(jié)果及臨床癥狀可以確認(rèn)鉤吻堿為本起食物中毒事件的中毒因子。SIM 模式僅監(jiān)測選定目標(biāo)離子，能更好地排除基質(zhì)和雜質(zhì)的干擾。

圖3 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品譜圖對比圖

2.2 定量結(jié)果

在SIM 模 式 下 以m/z 108、279、322、251 為 監(jiān)測離子，m/z108 為定量離子，依次進(jìn)樣0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的 鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以濃度為橫坐標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行一次線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，一次線性方程為：Y=106 808.5X+12 421.96，R2=0.999 8；線性良好；滿足定量要求。在相同儀器條件下對樣品進(jìn)行測定，使用LabSolution 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對檢測結(jié)果處理。樣品定量結(jié)果見表1。患者嘔吐物、洗胃液、鉤吻根豬腳湯中均檢出鉤吻堿，其中鉤吻根豬腳湯中含量最高為6.780 mg·kg-1，而鉤吻堿大鼠腹腔注射半數(shù)致死劑量（LD50）為1.2 mg·kg-1[8]，湯中的鉤吻堿含量遠(yuǎn)超中毒劑量，可以判定患者是食用了鉤吻豬腳湯導(dǎo)致的鉤吻堿中毒。鉤吻堿毒性強(qiáng)，致死劑量低，中毒病亡率高達(dá)47.6%。有報道稱鉤吻根3 g 左右、嫩芽7 個、流浸膏3.5 ～5.0 mL 或鉤吻堿0.15 ～0.30 g 即可致死。

表1 GC-MS 檢測結(jié)果表

3 討論與結(jié)論

目前，鉤吻堿檢測方法有氣相色譜法（GC）[9-10]、 高效液相色譜法（HPLC）[11-12]、氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （HPLC-MS/MS）[14-15]。GC、HPLC 靈敏度低、僅依據(jù)保留時間定性，需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做參比，遇到結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)難以分離、定性能力弱不適用于食物中毒的應(yīng)急檢測；LC-MS/MS 有較高的靈敏度、準(zhǔn)確的定性能力和高速的分析效率是鉤吻堿常見的檢測方法，但三重四級桿質(zhì)譜儀不能配制標(biāo)準(zhǔn)譜庫，不具備未知檢測目標(biāo)的檢索能力，定性能力對標(biāo)準(zhǔn)品依賴較高，在應(yīng)急檢測工作中具有很大的局限性。GC-MS 分析效率、靈敏度、準(zhǔn)確度同LC-MS/MS 相當(dāng)，可配備Nist 17 質(zhì)譜庫（210 000 余種化合物，240 000 余張譜圖）和Wiley 質(zhì)譜庫（300 000 余種化合物，400 000 余張譜圖）[16]，等多種標(biāo)準(zhǔn)譜庫，基本涵蓋了常見揮發(fā)性毒物，可進(jìn)行譜庫檢索定性，二級質(zhì)譜圖確證，具有無需標(biāo)準(zhǔn)品即可定性和定性準(zhǔn)確的優(yōu)勢，適合食物中毒應(yīng)急檢測的需要。鉤吻堿本身是堿性物質(zhì)根據(jù)相似相溶原理，堿性溶液提取率較高，報道中多使用堿性溶液浸提、醇溶液提取、或酸性溶液提取后調(diào)節(jié)pH至堿性后采用有機(jī)溶劑提取[17-18]。水作為提取溶劑低廉、無毒、易得，但提取效率低，提取液不能直接用于GC-MS 測定；酸可以和生物堿反應(yīng)形成鹽，同時沉淀酸不溶性物質(zhì)，但由于鹽的特性提取純度不高，且不易分離；生物堿多可溶于醇和三氯甲烷，且三氯甲烷提取效率較高，考慮氯仿直接提取時雜質(zhì)含量較高，一般采取先使用堿性溶液提取，再使用三氯甲烷萃取的方法?？紤]到應(yīng)急檢測的時效性和GC-MS特性，本次應(yīng)急檢測使用10%NaOH 溶液提取，三氯甲烷液液萃取，過0.22 μm 微孔濾膜后，使用氣質(zhì)Scan 模式全掃描Nist17 譜庫檢索定性，比對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)全掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行確證，使用SIM 模式進(jìn)行定量，該方法前處理過程簡單高效，定性定量準(zhǔn)確。GC-MS 作為精密貴重儀器，多配備在市級以上實(shí)驗(yàn)室，而鉤吻堿中毒事件多發(fā)于欠發(fā)達(dá)山區(qū)，若當(dāng)?shù)貦z測機(jī)構(gòu)可能未配備這類儀器設(shè)備， 可利用相對簡易的儀器開展鉤吻堿中毒的定性實(shí)驗(yàn)，如薄層色譜（TLC）法[19-20]、特異顯色反應(yīng)法[21]等也能在此類應(yīng)急檢測中發(fā)揮相應(yīng)作用。

氣質(zhì)聯(lián)用儀SIM 模式下的選擇性離子掃描有效降低復(fù)雜基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，對樣本的凈化程度依賴低，有效縮短前處理時間。Scan 模式下可通過標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索實(shí)現(xiàn)危害因子的精準(zhǔn)識別，定性能力不依賴標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用于中毒樣品中鉤吻堿的檢測具有高效準(zhǔn)確的特性，能應(yīng)對食物中毒的突發(fā)性和檢測目標(biāo)的不確定性，滿足應(yīng)急檢測速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確度高的要求。