◎ 呂 警，張建平，崔銀倉

（1.烏魯木齊市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆昌源水務(wù)科學(xué)研究院有限公司，新疆 烏魯木齊 830000）

磺胺類獸藥，是一類具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的磺胺類獸藥[1]，具有抗菌性[2]，且價(jià)格較低，應(yīng)用效果理想，特別是在食源性動(dòng)物細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防與治療中，受到了行業(yè)人士的青睞。鑒于在動(dòng)物身上有殘留的磺胺類獸藥，如果人體長(zhǎng)時(shí)間攝入，就會(huì)引發(fā)過敏等現(xiàn)象，嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)剝脫性皮炎，嚴(yán)重危害到人們的生命健康[3]。隨著時(shí)代的發(fā)展，食品檢測(cè)行業(yè)人士經(jīng)過多年的研究，致力于推出檢測(cè)食物殘留磺胺類獸藥的方法，就是希望能夠維護(hù)好人們的生命健康。磺胺的分析方法主要有酶聯(lián)免疫法[4]、膠體金免疫層析法、毛細(xì)管電泳法、表面等離子體共振技術(shù)、阻抑速差催化光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]等。本研究通過開發(fā)快速、簡(jiǎn)便的樣品前處理方法，建立了雞肉中12 種磺胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，能夠滿足對(duì)雞肉樣品中的磺胺類藥物進(jìn)行快速篩查和定量的 要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈為色譜純，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 高純水；磺胺甲基異惡唑、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺氯噠嗪，純度均大于97%，均購自Dr.Ehrenstorfer Gmbh 公司。

Xevo TQS-micro 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公 司）、Milli-Q 超 純 水 儀（美 國(guó)Millipore公司）、3-18K 冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）、 KQ-700DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、MS3 渦旋儀（德國(guó)IKA 公司）及R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （瑞士Buchi 公司）。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：沃特世ACQUITY UPLC BEH C18 柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL·min-1；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3 質(zhì)譜條件

ESI 離子源：正離子掃描；毛細(xì)管電壓：1.5 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑氣溫度：500 ℃；去溶劑氣流量（氮?dú)猓?00 L·h-1；氣簾氣流量：50 L·h-1；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描（MRM）；所有物質(zhì)的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 所有待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜分析參數(shù)表

1.4 樣品處理

稱取2 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 塑料離心管中，加入15 mL 乙腈溶液，再加入緩沖鹽包SBEQ- CA8802-B，渦旋混合5 min，超聲波提取10 min， 5 000 ～10 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液加至需要的凈化管，重復(fù)提取兩次，合并兩次提取液。

上述提取液按先后順序依次加入到凈化管中，渦旋混合5 min，5 000 ～10 000 r·min-1離心5 min。取出凈化管中所有上清液，40 ℃減壓蒸發(fā)至近干。加入1 mL 乙腈-水溶液（1 ∶1）溶解，渦旋混合1 min，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別稱取各磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容[6]，配成1.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐級(jí)稀釋成濃度分別為0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、 0.10 μg·mL-1和0.20 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.6 精密度和回收率測(cè)定

取雞肉空白基質(zhì)配制成添加水平為10 μg·kg-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算回收率和標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

相比較于甲醇和丙酮，分析樣品沉淀蛋白質(zhì)結(jié)果，乙腈表現(xiàn)出了良好的使用效果，本次在開展試驗(yàn)探究中，檢測(cè)人員所使用的提取溶劑主要是乙腈。

2.2 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

通過實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，針對(duì)磺胺類物質(zhì)，其內(nèi)部含有較多的氨基基團(tuán)，檢測(cè)人員確定的離子化模式主要是ESI+。檢測(cè)人員在分析一級(jí)質(zhì)譜環(huán)節(jié)中，應(yīng)用的是直接式進(jìn)樣，面對(duì)藥物中的準(zhǔn)分子離子峰（[M+H]+），逐一實(shí)施針對(duì)性的研究，檢測(cè)人員嚴(yán)格按照行業(yè)探究規(guī)范，確定好各項(xiàng)數(shù)據(jù)，保證最終試驗(yàn)結(jié)果具備較高精確性以及可靠性。

通過深入調(diào)查可以看出，分析磺胺藥物，其中主要涵蓋m/z 92 和m/z 156 等多種二級(jí)質(zhì)譜離子碎片。通過選取不同的碰撞能量（0 ～40 eV）和表1 梯度洗脫程序?qū)前粪彾籽踵奏?、磺胺間二甲氧嘧啶分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎片分析，研究發(fā)現(xiàn)，分別在30 eV、28 eV的碰撞能量下，能有效分離磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶化合物。

2.3 流動(dòng)相條件

相比較于甲醇+0.1%甲酸水溶液，乙腈+0.1%甲酸水溶液有著理想的色譜行為。甲酸為磺胺化合物提供質(zhì)子，能夠保證磺胺藥物離子化順利進(jìn)行，與此同時(shí)，甲酸能夠確保質(zhì)子化色譜柱內(nèi)的硅羥基，減少磺胺藥物形成氫鍵，在極高響應(yīng)效果下，更不會(huì)產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。鑒于此，在本次試驗(yàn)研究中，確定的流動(dòng)相為乙腈+0.1%甲酸水溶液。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在當(dāng)前行業(yè)人士觀點(diǎn)當(dāng)中，在進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，其中基質(zhì)形成機(jī)理并沒有確定，主要就是在藥物殘留當(dāng)中，不管是基質(zhì)還是等待檢測(cè)的磺胺藥物，都處于離子源處競(jìng)爭(zhēng)離子化。經(jīng)過分析可知，在相同的條件下，開展液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，針對(duì)磺胺藥物響應(yīng)值，與樣品基質(zhì)之間有著直接的關(guān)系，隨著響應(yīng)值忽強(qiáng)或者是忽弱等現(xiàn)象下，從中并不能總結(jié)出相應(yīng)的規(guī)律。鑒于基質(zhì)效應(yīng)問題下，本實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品基質(zhì)溶液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 線性范圍與檢出限

用 陰 性 樣 品 基 質(zhì) 溶 液 配 制0.01 μg·mL-1、 0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1和 0.20 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照上述設(shè)定的條件進(jìn)行分析測(cè)定，以質(zhì)量濃度、峰面積分別作為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 各種磺胺藥物的表征參數(shù)表

由表3 可知，在0.01 ～0.20 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)，各種磺胺的相關(guān)系數(shù)r 均大于0.999。檢出限按照3 倍信噪比計(jì)算。

2.6 精密度和回收率測(cè)定結(jié)果

由表4 可知，10 μg·kg-1添加范圍的平均回收率為87.6%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.53%～11.60%。

表4 回收率與精密度表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了QuEChERS 結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中12 種磺胺藥物殘留的分析方法，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，大大縮短了前處理周期，節(jié)約了檢測(cè)成本。本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可有效去除基質(zhì)中蛋白的干擾，提高了磺胺藥物測(cè)定的靈敏度。