◎ 曹 維，譚 杰，鄭茜玥

（武漢海關(guān)技術(shù)中心，湖北 武漢 430050）

國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）限定了食品動物中甲砜霉素等藥物殘留限量，但食品中有關(guān)氯霉素及甲硝唑等藥物殘留事件報(bào)道仍較多[1]。獸藥殘留為目前食品安全面臨的重大問題之一[2-3]?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法為食品中多種獸藥殘留快速定性篩查的首選方法，且具有分析效率高、靈敏度高的優(yōu)勢[4]，本文就超高效相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在動物源性食品檢測中應(yīng)用效果進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。LC-30 超高效液相色譜儀（日本島津公司）、ATRAP 5500 三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）、Multi Reax 全能型振蕩器（德國Heidolph 公司）、Centrifuge 5804 高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）、SCIENTZ-950E 超聲波提取器（寧波新芝生物科技公司）、Autovap S60 氮吹儀（美國ATR 公司）、XS-205 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）、Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)（美國MILLI-PORE 公司）、HYPERSEP Retain-PEP 固相萃取柱（美國賽默飛公司）、陶瓷均質(zhì)子（美國安捷倫公司）以及0.22 μm PFP 微孔濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

（2）試劑與樣品。氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品；豬肉粉中氯霉素、氟苯尼考分析質(zhì)控樣；乙腈、甲醇和甲酸；實(shí)驗(yàn)用水。樣本為當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場所采購豬肉、牛肉及羊肉，總計(jì)68 批。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

樣品切碎后，準(zhǔn)確稱量5 g 樣品置于50 mL 聚丙烯具塞離心管中，加50 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液，放置30 min 后，加pH=9.0 磷酸鹽緩沖液5 mL，渦旋振蕩5 min 后，加乙腈5 mL，混勻后，以1 000 r·min-1冷凍離心共10 min，去上清液后置另一個(gè)離心管中，加乙酸乙酯10 mL，渦旋30 s 后，靜置分層，于1 000 r·min-1冷凍離心10 min，去上層液，置15 mL 聚丙烯離心管，40 ℃以下水浴中，氮?dú)獯抵两?，殘留物?.3 mL甲醇溶液，加5.7 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻待凈化。

1.2.2 溶液配制

取標(biāo)準(zhǔn)品氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素，溶于甲醇配制為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度為1 mg·mL-1，置于-20 ℃ 下避光保存，有效期6 個(gè)月。量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋至10 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液，保存在2 ～8 ℃，有效期1 個(gè)月。按1.2.1 處理后，獲取陰性樣品，按照混合標(biāo)準(zhǔn)，配制為質(zhì)量濃度1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、 20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1混合液。

1.2.3 分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITYUPLC BEH C18 柱；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流速： 0.4 mL·min-1；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3.0 min，90%A →60%A； 3.0 ～3.5 min，60%A →15%A，3.5 ～4.0 min， 15%A →10%A，4.0 ～4.5 min，10%A →90%A， 4.5 ～6.0 min，90%A；進(jìn)樣量：10 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧電離源，負(fù)離子掃描，多反應(yīng)模式監(jiān)測。毛細(xì)管電壓：2.5 kV（負(fù)離子）和4.0 kV（正離子）；離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1，碰撞氣流量：0.13 mL·min-1。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的離子對、去簇電壓、碰撞氣能量和碰撞室出口電壓見表1。

表1 質(zhì)譜條件相關(guān)參數(shù)表

1.2.4 線性分析

陰性樣品處理液獲取混合配制，1 ng·mL-1、 5 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和 100 ng·mL-1系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并上機(jī)測定。將目標(biāo)化物定量離子峰面積歸為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度測定

對質(zhì)量濃度為10.0 ng·mL-1的3 種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶 液，開展6 次重復(fù)測定，測定精密度。

1.2.6 樣品測定

吸取1 mL 上清液加入使用前依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化處理過的弱陰離子固相萃取柱中，待樣品以低于1.0 mL·min-1的流速全部通過固相萃取柱，再分別用3 mL 去離子水和3 mL 甲醇淋洗，流速為 1 mL·min-1，應(yīng)用10 mL 2%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液在45 ℃水浴中氮吹至近干，應(yīng)用60%甲醇-水 溶液定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上機(jī)測定。按照液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，樣品中待測物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物質(zhì)的保留時(shí)間偏差在±2.5%。定量測定時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定，定性是應(yīng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對峰度一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件和色譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化：4 種目標(biāo)化合物響應(yīng)值具有差異性，配制100 ng·mL-1目標(biāo)物溶液，流動注射三通進(jìn)樣方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，設(shè)置碰撞電壓1 eV，調(diào)節(jié)錐孔電壓使準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)值最大，當(dāng)椎體電壓為30 V 時(shí)氯霉素和氟甲砜霉素產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子[M+H]+并分別為m/z192、m/z202，響應(yīng)值最高。當(dāng)碰撞電壓為18 eV 時(shí)，甲砜霉素可產(chǎn)生子離子m/z160。

色譜條件優(yōu)化：根據(jù)試樣中被測樣液的含量情況，選取待測物的響應(yīng)值在一定線性相應(yīng)范圍內(nèi)的濃度進(jìn)行測定。在1.2.3 色譜條件下氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素參考保留時(shí)間分別為6.1 min、4.9 min、4.5 min。 各個(gè)目標(biāo)化合物分離良好，且色譜峰峰型良好。

2.2 線性范圍

測得目標(biāo)化合物在1.0 ～100 ng·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6 878.82x，相關(guān)系數(shù)r ≥0.992 9。

2.3 精密度測定結(jié)果

如表2 所示，對質(zhì)量濃度為10.0 ng·mL-1的3 種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，開展6 次重復(fù)測定，測得結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～2.3%，說明儀器具備良好精密度。

表2 精密度測定結(jié)果表

2.4 樣品測定結(jié)果

如表3 所示，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限為0.1 μg·kg-1。本次方法中檢出值為0.3 μg·kg-1，低于標(biāo)準(zhǔn)方法檢測低限、檢測限（SN/T 2289—2009），氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限均為0.5 μg·kg-1；表明上述方式靈敏度高。

表3 樣品測定結(jié)果表

3 結(jié)論

超高效相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法特點(diǎn)為高效、快速，為食品安全及質(zhì)量檢測中開辟新的途徑。相較傳統(tǒng)高效液相色譜，采取更小微粒柱填充材料及較高泵壓，分離效果更為顯著[5]。研究結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在1.0 ～100 ng·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6 878.82x，相關(guān)系數(shù)r ≥0.992 9。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限為0.1 μg·kg-1。精密度測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～2.3%，說明方法具備良好的精密度。本次方法中，氯霉素類藥物檢出值為0.3 μg·kg-1，低于標(biāo)準(zhǔn)方法檢測低限、檢測限。綜上，超高效相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法簡單、快捷、靈敏度高，可滿足食品及保健食品市場監(jiān)管及檢驗(yàn)需求。