◎ 夏祎稚，邵衛(wèi)樑

（上海交大昂立股份有限公司，上海 200233）

世界衛(wèi)生組織（WHO）指出，酒精中毒是當(dāng)今世界范圍內(nèi)的公害之一[1]。飲酒過度現(xiàn)象以及由酒精所引發(fā)的疾病和問題也日益增多，且進入體內(nèi)的乙醇大部分經(jīng)肝臟代謝，對肝臟具有較大的損害，例如，使肝細胞膜表面的脂質(zhì)過氧化以及破壞肝細胞膜。長期飲酒還會使肝細胞內(nèi)的微管和線粒體等結(jié)構(gòu)受到破壞，使細胞內(nèi)的代謝紊亂，產(chǎn)生具有細胞毒性的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致肝細胞腫脹、壞死等。

針對過量飲酒或酒精中毒等，目前已有相關(guān)的化學(xué)藥和中藥，但是化學(xué)藥本身也需要經(jīng)肝臟代謝，代謝過程對肝臟同樣具有毒性，故西藥、化學(xué)藥只能在即時解決酒醉的不良反應(yīng)，不能作為長期調(diào)理肝臟的藥品。同樣地，針對解酒的中藥，大部分是根據(jù)中藥古方文獻記載以及根據(jù)現(xiàn)代藥理組合形成的中藥復(fù)方，雖能暫時緩解頭暈、惡心等癥狀，但很多都含有使人興奮的活性成分，只能治標(biāo)不能治本。

因此本研究注重于所述組合為國家法規(guī)規(guī)定屬無毒級別的原料，其中主要原料包括藥食兩用中藥原料（主要包括枳椇子、葛根等）、復(fù)配益生菌與維生素等。將上述所述原料組合制備成產(chǎn)品——“甘氧片”。通過多個途徑參與乙醇的代謝過程，降低乙醇對機體的傷害（包括降低乙醇、氧自由基和乙醛對機體的傷害）、調(diào)節(jié)乙醇代謝過程相關(guān)鍵酶活性尤其是提高乙醇脫氫酶活性加速乙醇代謝、提高乙醛脫氫酶活性、降低乙醛對機體傷害。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR 小鼠，SPF 級，雄性，體重20 ～25 g（6 ～8 周 齡），50 只。來源：上海市計劃生育科學(xué)研究所實驗動物經(jīng)營部；生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0006；質(zhì)量合格證編號：20180006022598。

1.2 受試樣品

“甘氧片”產(chǎn)品樣品：由上海交大昂立股份有限公司提供；規(guī)格：0.75 g/片；保存條件：4 ℃保存。

1.3 試劑與儀器：

ALC-210.3 電子天平（賽多利斯斯泰帝（上海）貿(mào)易有限公司）、PL601-L 電子天平（梅特勒.托勒多公司）、HITACHI 7080 生化檢測儀（日立公司）。

乙醇（批號：20190525，國藥集團化學(xué)試劑公司）、羧甲基纖維素鈉（CMCNa，批號：20190303，國藥集團化學(xué)試劑公司）、乙醇脫氫酶測試盒（批號：20201229，上海索橋生物科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 劑量設(shè)計

“甘氧片”的成人使用量為9 g·d-1，動物用量為人體的10 倍和20 倍，計算如下：9×10 倍÷60 kg= 1.5 g·kg-1，擬采用1.5 g·kg-1和3 g·kg-1。試驗研究過程 中，考慮樣品的有效性，選擇人體服用量10 倍和 20 倍的兩個劑量，沒有做30 倍劑量組。給藥途徑及容積：口服（PO），25 mL·kg-1[2]。

1.4.2 試劑與受試樣品的配制

試劑配制：50%乙醇；賦形劑：0.5% CMCNa。受試樣品制備：受試樣品按相應(yīng)人體服用量倍數(shù)的濃度溶入賦形劑中。

1.4.3 操作步驟

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，小鼠被隨機分成4 組（正常組、醉酒組、醉酒+樣品10倍量組、醉酒+樣品20倍量組），每組10 個動物。試驗前一日下午小鼠禁食不禁水16 h， 試驗當(dāng)日上午，各組小鼠稱重后給予賦形劑 （0.5% CMCNa）、受試物進行灌胃（體積25 mL·kg-1）， 0.5 h 后，各組小鼠給予50%乙醇20 mL·kg-1，記錄醉酒潛伏期（灌酒后至翻正反射消失）、醉酒時間（反射消失至反射恢復(fù)）。蘇醒后，摘眼球取血，分離血清，測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（T-BIL）和堿性磷酸酶（ALP）等肝功能指標(biāo)；取肝右葉0.3 g 左右，精確稱定，-80 ℃保存，用于測定乙醇脫氫酶。

1.4.4 觀察指標(biāo)

醉酒潛伏時間：灌酒后至翻正反射消失。醉酒恢復(fù)時間：灌酒后至翻正反射恢復(fù)。肝功能ALT、AST、T-Bil 、ALP 指標(biāo)變化。微量法測定肝臟中乙醇脫氫酶活性，結(jié)果以每克肝臟組織的催化能力表示，單位為μmol/min/g。

1.4.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用非成對t-test檢驗，與模型組進行組間比較，p ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠醉酒誘導(dǎo)時間、醒酒時間及死亡率

各組小鼠給予賦形劑或解酒樣品處理后0.5 h，灌服50%酒精，醉酒誘導(dǎo)時間、醒酒時間和死亡率如表1 所示。受試樣品10 倍劑量組與20 倍劑量組醉酒誘導(dǎo)時間均長于模型組，且與模型組差異有統(tǒng)計意義 （p ＜0.05，p ＜0.01）；醉酒恢復(fù)時間，受試樣品10 倍劑量組與20 倍劑量組少于模型對照組（p ＜0.05，p ＜0.05）；從醉酒存活率觀察，20 倍劑量組樣品存活率最高（90%），10 倍劑量組樣品存活率次之（80%），模型組存活率最低（60%），以上結(jié)果提示，“甘氧片”具有較好解酒作用。同時能有效提高小鼠存活率，且高劑量組存活率更高，可能與其具有保肝作用有關(guān)。

表1 小鼠醉酒存活率、誘導(dǎo)時間和醒酒時間表

2.2 對于醉酒小鼠肝功能指標(biāo)影響[3]

各組小鼠肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（T-BIL）和堿性磷酸酶（ALP）結(jié)果如表2 所示。與正常組相比，給予醉酒誘導(dǎo)的模型組小鼠ALT、AST、TBIL 和ALP 明顯升高（p ＜0.05、p ＜0.001、p ＜0.000 1 和p ＜0.05），表明酒精對肝損傷模型完成建立。與模型組比較：ALT指標(biāo)，樣品組10 倍劑量和20 倍劑量都顯著性降低 （p ＜0.05、p ＜0.01）；AST 指標(biāo)，樣品組10 倍量無顯著性差異，20 倍量顯著低于模型組（p ＜0.05）；T-BIL 指標(biāo)，樣品組10 倍和20 倍量都顯著低于模型組（p ＜0.01、p ＜0.05）；ALP 指標(biāo)，樣品組10 倍量和20 倍量都顯著低于模型組（p ＜0.05，p ＜0.05）。

表2 小鼠肝功能指標(biāo)測定結(jié)果表

2.3 肝臟中乙醇脫氫酶含量

各組小鼠肝臟中乙醇脫氫酶（Alcohol dehydro- genase，ADH）活性如表3 所示，模型組與正常組相比，乙醇脫氫酶活性差異無統(tǒng)計意義（p=0.715 8），與樣品組10 倍量相比也無顯著性差異，與20 倍量組相比具顯著性差異，樣品20 倍量組肝臟中乙醇脫氫酶活性顯著高于正常組（p ＜0.05）。

表3 小鼠肝臟中乙醇脫氫酶活性表（單位：μmoL/ml/g）

3 結(jié)論與討論

乙醇進入人體后約20%通過胃吸收，80%經(jīng)十二指腸吸收，其中絕大部分（90%以上）的酒精在肝臟代謝。乙醇經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）和肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)（MEOS），在肝臟中氧化了大部分的乙醇，其代謝途徑的第一階段主要是乙醇在肝細胞質(zhì)經(jīng)過ADH 氧化為乙醛，而MEOS 也將乙醇轉(zhuǎn)變成為乙醛（對于嗜酒者，ADH 已不能全部完成乙醇的代謝，這時機體會生成混合功能氧化酶），其限速酶主要是細胞色素酶系中亞家族P4502E1。第二階段為乙醛在肝細胞線粒體中被乙醛脫氫酶（ALDH）或乙醛氧化為乙酸，后者釋放進入血液，在外周組織中被氧化為二氧化碳和水，進而完成整個代謝過程[4]。

乙醇通過誘導(dǎo)細胞色素氧化物（P4502E1），通過微粒體乙醇氧化途徑，產(chǎn)生大量乙醛和多種氧自由基，經(jīng)研究證實氧自由基及乙醛是造成肝損傷的重要原因[5]。因此，乙醇在代謝過程中，除乙醇本身對人體的組織細胞的傷害，其代謝過程產(chǎn)生的氧自由基和乙醛對人體也具有巨大危害。許多人飲酒過度，超出人體酒精代謝的限度，要經(jīng)細胞色素氧化物（P4502E1）代謝，會產(chǎn)生大量氧自由基，更會加深對人體組織細胞特別是肝臟的損傷，以及加快肝臟功能的衰退，對人體的健康構(gòu)成了極大的威脅。

乙醛對肝臟的主要毒性作用為：降低肝臟對脂肪酸的氧化；影響肝臟微管系統(tǒng)，使微粒蛋白分泌減少，造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在肝細胞中沉積；促進脂質(zhì)過氧化，使還原型谷胱甘肽（GSH）減少，并增加膠原合成，乙醛又和一些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）等形成蛋白加合物，引起免疫反應(yīng)，損害細胞骨架功能和細胞與間質(zhì)的相互作用，從而抑制重要的代謝通路[6]。

乙醛同時也使細胞色素氧化物（P4502E1）高度誘導(dǎo)并激活巨噬細胞，產(chǎn)生大量的·OH，·O2-，和H2O2等自由基。這些氧自由基可使DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生線粒體損害（能量產(chǎn)生減少），使肝細胞損傷，發(fā)生肝細胞的凋亡和壞死。肝內(nèi)的枯否細胞和來自血循環(huán)的單核細胞在肝損傷后被激活，同時由于酒精使腸道通透性升高，致使循環(huán)中腸道來源的內(nèi)毒素增高，內(nèi)毒素血癥可能通過枯否細胞、P4502E1 釋放氧自由基、和其他細胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF-α）等，不但對肝細胞有損害，而且對肝竇內(nèi)皮細胞有害，肝竇內(nèi)皮細胞受損后，可使黏附分子表達增加并釋放許多損害肝細胞的細胞因子，引起循環(huán)損傷[6]。

針對乙醇在代謝過程及其產(chǎn)物對人體的傷害，本研究依據(jù)中醫(yī)藥文獻記載解酒保肝護肝經(jīng)典藥味及復(fù)方、根據(jù)乙醇代謝過程對機體的傷害途徑從分子藥理學(xué)原理阻止或減少對機體的傷害（包括降低乙醇、氧自由基、乙醛對機體的傷害）、調(diào)節(jié)過程相關(guān)酶活性及通過針對性的提高乙醇脫氫酶活性加速乙醇代謝，提高乙醛脫氫酶活性，降低乙醛對機體傷害。此外組合中增加強抗氧化活性成分，減少因乙醇代謝過程產(chǎn)生的自由基對機體的傷害。以期通過多途徑達到即時解酒，長期調(diào)理保肝護肝的目的。

在本研究樣品“甘氧片”中含有藥食兩用中藥成分，其中藥水提物有超強的抗自由基活性，可顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，能顯著降低丙二醛（MDA）含量，能提高神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)生長因子（brain nerve growth factor，BDNF）表達，改善血液流變學(xué)，改善慢性腦缺血大鼠的認知能力，對醒酒具有顯著性效果，其提高NGF 和BDNF 表達機理尚待進一步研究。

樣品中還添加了其他有助于解酒保肝的食品原料，如B 族維生素、維生素C、牛磺酸等。①B 族維生素可作為機體反應(yīng)酶的合成原料，可改善脂肪蛋白質(zhì)的代謝，助消化，并參與體內(nèi)各種蛋白酶的作用和體內(nèi)多種新陳代謝反應(yīng)。充足的B 族維生素，能避免肝脂肪變性，提高肝臟對乙醇的耐受力，消除乙醇和煙焦油等內(nèi)毒素，保護肝臟，從而具有養(yǎng)肝功效[7]。②維生素C 是一種強還原劑，保護其他抗氧化劑，防治自由基對人體的傷害，保護細胞、解毒、保護肝臟。它還能促進許多體內(nèi)抗氧化酶的氧化型轉(zhuǎn)為還原型，從而持續(xù)發(fā)揮抗氧化作用[8]。③?；撬崾莿游锛毎麅?nèi)含量最豐富的含磺酸基的β-氨基酸，可以維持組織滲透壓穩(wěn)定細胞膜、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫力、維持細胞鈣離子水平、保護線粒體、抑制肝細胞活性氧產(chǎn)生以及明顯提高肝臟中ADH 和ALDH 的活性，減少過氧化物酶的釋放，可有效保護肝細胞。同時?；撬徇€可以抑制脂質(zhì)過氧化，減少MDA 并保護胰島B 細胞功能等廣泛生物學(xué)效應(yīng)；還具有加速乙醇的代謝、抗炎等多種生理功能。

實驗研究結(jié)果表明，樣品“甘氧片”在醉酒誘導(dǎo)時間與醒酒時間的行為觀察中，10 倍和20 倍劑量組與模型對照組比較都具顯著性差異，表明具有顯著的解酒作用。肝功能指標(biāo)（ALT、AST、T-BIL 和ALP）與模型對照組比較，樣品組人體10 倍和20 倍劑量組都各具有改善肝功能指標(biāo)的顯著性差異。由于本產(chǎn)品具有保護肝臟的作用，可使小鼠在試驗酒精的濃度下，致死率從40%（考慮后續(xù)實驗進行，沒有設(shè)計高致死率模型）顯著降低至10%。試驗結(jié)果中可見，對健康小鼠而言，由于乙醇有對乙醇脫氫酶（ADH）的代償性作用，其代償機理如前所述，乙醇通過誘導(dǎo)限速酶P4502E1，加快乙醇代謝，因此在酒后短期內(nèi)（2 h），ADH 活性會降低，數(shù)小時后，ADH 活性會恢復(fù)。本實驗也證明了所述理論。模型組與正常組對照，10 h以后，肝臟乙醇脫氫酶活性無顯著性差異。但“甘氧片”樣品實驗組與正常組比較，20 倍劑量的ADH 指標(biāo)具有活性提高的顯著性差異，表明實驗樣品對乙醇傷害具有長期的保護肝臟功能作用。

綜上所述，產(chǎn)品“甘氧片”運用各原料的合理配伍，通過多個途徑參與乙醇的代謝過程，降低乙醇及其代謝過程的代謝物對機體的傷害，因此既能即時解酒，又能長期服用以保肝護肝。